柯明輝 陸 興 劉保興 王傳航

中日友好醫(yī)院男科（北京 100029）

由于生活方式和環(huán)境發(fā)生變化、生育年齡推遲等因素，男性不育的發(fā)病率不斷增高[1]。大部分不育患者無法找到明確病因，僅表現(xiàn)為精子質(zhì)量下降，根據(jù)臨床經(jīng)驗和WHO制定的指導(dǎo)意見[2]，精子總數(shù)可以衡量睪丸產(chǎn)生精子的能力，與生育結(jié)局關(guān)系最密切，因此少精子癥最容易導(dǎo)致男性不育。少精子癥的病因目前尚不明確，但生精細(xì)胞和精子凋亡被認(rèn)為可能是導(dǎo)致生精障礙的一個原因[3]。中醫(yī)認(rèn)為男性不育少精子癥的主要病機(jī)是腎精虧虛，補(bǔ)腎填精法是基本治法，五子衍宗丸被公認(rèn)是該治法的代表方藥，臨床上已取得了較好的療效，很多治療不育癥的方劑都是以該方為基礎(chǔ)方。為了進(jìn)一步明確五子衍宗丸治療男性不育少精子癥的療效和機(jī)制，筆者設(shè)計了以下研究。

資料與方法

一、總體設(shè)計

未設(shè)立對照組的研究又稱單組研究，存在不夠嚴(yán)謹(jǐn)、證據(jù)等級不高的缺點，但單組研究因為所有受試者都接受同一種藥物治療，具有容易操作、耗費(fèi)資金少、較快獲得結(jié)果的優(yōu)點，對于尚無公認(rèn)有效治療藥物或共識中無金標(biāo)準(zhǔn)治療方案的疾病的研究，以及無法找到合適對照藥物的疾病的研究，可以考慮使用單組研究設(shè)計[4]。目前男性不育治療藥物中，五子衍宗丸是最被認(rèn)可的藥物，常被用作臨床研究中的對照藥物，因此本研究不設(shè)對照組采用單組研究設(shè)計。

二、研究對象

研究對象為2015年3月至2016年10月來中日友好醫(yī)院男科就診的男性不育少精子癥患者50例，均符合腎精虧虛辨證標(biāo)準(zhǔn)。

（一）西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考世界衛(wèi)生組織《人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》第五版[2]制定了以下標(biāo)準(zhǔn)。

1. 男性不育診斷標(biāo)準(zhǔn)：未采取避孕措施，婚居1年或1年以上配偶未懷孕，并且排除了女方的因素，即可診斷為男性不育。

2. 少精子癥的判定標(biāo)準(zhǔn)：（1）精子總數(shù)＜39×106，且≥5×106（排除了重度少精子癥）；（2）精液量≥1.5mL（排除輸精管道梗阻、逆向射精或標(biāo)本采集不全等）；（3）一周內(nèi)連續(xù)檢測2次，均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)才能入組，選擇精子總數(shù)較多的檢測結(jié)果進(jìn)行記錄。

（二） 中醫(yī)腎精虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)

該辨證標(biāo)準(zhǔn)是參考國家中醫(yī)藥管理局的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語》證候部分制定[3]。

1. 主癥：精子總數(shù)減少、婚后不育；腰膝酸軟；精神萎靡。

2. 次癥：頭暈；耳鳴；健忘；乏力；失眠多夢；足跟疼痛。舌淡苔白，脈沉細(xì)弱。 具備主癥第一項和其他任意一項主癥，同時具備次癥2項即可診斷。

（三） 納入標(biāo)準(zhǔn)

1. 年齡≥20歲且≤59歲。

2. 符合男性不育診斷標(biāo)準(zhǔn)和少精子癥判定標(biāo)準(zhǔn)。3. 符合中醫(yī)腎精虧虛辨證標(biāo)準(zhǔn)。

4. 入選前3個月內(nèi)未服用任何有生精作用的藥物。

5. 簽署入組知情同意書。

（四） 排除標(biāo)準(zhǔn)

1. 年齡＜20歲或＞60歲。

2. 工作環(huán)境為高溫或接觸放射線者。

3. 有不良生活習(xí)慣，如吸煙、酗酒、吸毒、經(jīng)常洗桑拿和長期熬夜。

4. 有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，或先天性生殖系統(tǒng)畸形、重度精索靜脈曲張、睪丸附睪炎等。

5. 不符合中醫(yī)腎精虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。

6. 近3個月參與了其他臨床試驗研究。

7. 近6個月有高熱病史（體溫＞39℃）。

（五）失訪標(biāo)準(zhǔn)

任何原因在第3個月末預(yù)約時間點（±7d）未能到診者。

三、治療方法

治療藥物五子衍宗丸（同仁堂股份有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字Z11020188，15106）具體成分為：枸杞子、菟絲子（炒）、覆盆子、五味子（鹽炒）、車前子。具體服藥方法為：飯后服用，6g bid。療程90d。

四、觀察內(nèi)容

（一）精子質(zhì)量

患者禁欲48h以上7d以內(nèi)，手淫取精后將全部精液留取到專用無菌杯中，立即放入37℃的恒溫水浴箱，待精液標(biāo)本完全液化后，按照世界衛(wèi)生組織《人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》第5版規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作流程及方法，用WLJY-9000型計算機(jī)輔助精子質(zhì)量自動分析系統(tǒng)（北京偉力新世紀(jì)公司生產(chǎn)）進(jìn)行精子質(zhì)量檢查。主要記錄指標(biāo)有精液量、精子總數(shù)和前向運(yùn)動精子百分率（%）。

（二）Caspase-3表達(dá)

由于經(jīng)費(fèi)限制，隨機(jī)選擇8例病例，治療前和治療90d后各檢測一次精子凋亡率。待測的精液標(biāo)本-80℃保存，采用Western blot法檢測凋亡，使用的主要試劑、抗體、儀器及檢測方法如下：

1. 主要試劑、抗體及實驗儀器：高速離心機(jī)（X I A N G Y I）、多重掃描M K 3酶標(biāo)儀（hermoVE180）、垂直電泳槽（Tanon）、高電流電泳儀（BioRad）、搖床（Kylin-Bell）、BCA蛋白定量分析試劑盒（Comwin Biotech ，02912E）、聚偏二佛乙烯膜（Merc Millipore，6001）、蛋白酶抑制劑混合物（Roche，0469311）、山羊抗兔IgG-HRP（Jackson，111-035-003）、山羊抗鼠IgGHRP（Jackson，115-035-003）、Caspase-3 抗體（proteintech ，19677-1-AP）。

2. 主要實驗步驟：蛋白抽提、定量、上樣蛋白制備。配制12%分離膠、5%濃縮膠，上樣（15μg/孔），電泳（濃縮膠恒壓90V，約20min；分離膠恒壓120V），轉(zhuǎn)膜（300mA恒流；0.45μm孔徑PVDF膜，時間90min），封閉（浸于5% BSA-TBST，水平搖床中孵育1h），一抗孵育（5% BSA-TBST稀釋，4℃水平搖床孵育過夜），次日洗膜（TBST洗3次，每次10min），二抗孵育（5% BSA-TBST稀釋二抗，室溫孵育 40min），洗膜（TBST洗3次，每次10min），曝光、顯影2min、定影。

（三）一般情況

記錄年齡、BMI、睪丸平均體積等指標(biāo)。睪丸體積在超聲醫(yī)生指導(dǎo)下進(jìn)行測量，計算公式：睪丸體積=上下徑×左右徑×前后徑×0.7，測量出兩側(cè)的睪丸體積后，取平均值得出睪丸平均體積。

（四）配偶妊娠情況

臨床觀察過程中密切進(jìn)行電話回訪，一旦患者回復(fù)配偶已經(jīng)妊娠，立即記錄配偶年齡等信息，該病例則可以退出。

五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與描述

計量資料符合正態(tài)分布或近似符合正態(tài)分布的采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，非正態(tài)分布的用中位數(shù)±四分位數(shù)間距的方式來描述。呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布的計量資料，采用配對樣本的t檢驗；非正態(tài)分布分布的計量資料，采用Wilcoxon符號秩和檢驗（Wilcoxon Signed-rank test）。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS統(tǒng)計軟件，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

結(jié) 果

一、總體完成情況

觀察期間，50例中4例因為配偶妊娠，退出臨床觀察；3例未在預(yù)約時間點（±7d）復(fù)診，視為脫落病例。4例配偶妊娠病例均有精子前向運(yùn)動精子百分率較高、配偶較年輕的特點。

二、治療前后精子質(zhì)量變化

治療后精液量有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后前向運(yùn)動精子百分率雖然未達(dá)到參考值標(biāo)準(zhǔn)，但顯著高于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；治療后精子總數(shù)達(dá)到參考值標(biāo)準(zhǔn)，明顯比治療前增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。具體結(jié)果見表1。

表1 治療前后精液參數(shù)變化

三、分組比較治療前后精子總數(shù)變化

根據(jù)既往文獻(xiàn)報道和臨床經(jīng)驗，患者的一些基本狀況可能會影響男性不育的治療效果。因此，根據(jù)年齡、體質(zhì)量、睪丸體積及精子前向運(yùn)動精子百分率這4個因素進(jìn)行分組討論。具體結(jié)果見表2。

（一）根據(jù)年齡分組

結(jié)果顯示20歲～和30歲～組治療后精子總數(shù)均明顯比治療前增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）；40歲～組由于病例數(shù)過少統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認(rèn)為治療后精子總數(shù)有增加趨勢。

（二）根據(jù)體質(zhì)量分組

正常組（1 8.5≤B M I＜2 5）和超質(zhì)量組（25≤BMI＜28）治療后精子總數(shù)明顯比治療前增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；肥胖組（28≤BMI＜32）由于病例數(shù)過少統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認(rèn)為治療后精子總數(shù)變化不明顯，反而略有下降趨勢。

表2 分組比較治療前后精子總數(shù)

（三）根據(jù)睪丸體積分組

正常組（睪丸體積＞12mL）治療后精子總數(shù)明顯比治療前增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；異常組（睪丸體積＜12mL）由于病例數(shù)過少統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認(rèn)為治療后精子總數(shù)有增加趨勢。

（四）根據(jù)前向運(yùn)動精子百分率分組

異常組（前向運(yùn)動百分率＜32%）治療后精子總數(shù)明顯比治療前增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；正常組由于病例數(shù)過少統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果不一定可靠，所以采用描述性分析，可以認(rèn)為治療后精子總數(shù)有增加趨勢。

四、治療前后精子Caspase-3的表達(dá)

對治療前與治療90d后凋亡指標(biāo)Caspase-3的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計分析，治療前Caspase-3為0.445±0.164，治療后為0.317±0.122，結(jié)果顯示治療后Caspase-3的表達(dá)顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體結(jié)果見圖1。

圖1 治療前后Caspase-3表達(dá)

討 論

70%左右的男性不育患者不能找到明確的病因，僅表現(xiàn)為精子總數(shù)、活力和形態(tài)方面的異常，足夠數(shù)量的前向運(yùn)動精子是使配偶受孕的必要條件，因此精子數(shù)量減少最容易導(dǎo)致男性不育，然而很少有專門針對少精子癥的臨床研究，這是本研究的一個亮點。

精子數(shù)量減少的具體病因尚不明確，生精細(xì)胞和精子過度凋亡被認(rèn)為可能引起生精障礙。國內(nèi)外均有研究[6,7]顯示不育患者的生精細(xì)胞和精子凋亡率顯著高于生育力正常的人群，劉媛等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)少精子癥患者的精子凋亡率顯著增高，而弱精子癥、畸形精子癥患者的精子凋亡率與正常人群無顯著差異。干預(yù)研究也得出了類似結(jié)論，他莫昔芬增加精子數(shù)量的原理可能是抑制生精細(xì)胞凋亡[9]，五子衍宗丸等補(bǔ)腎填精類中藥可以通過抑制生精細(xì)胞和精子的凋亡發(fā)揮促進(jìn)生精的作用[10,11]。Caspase-3被公認(rèn)是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，在凋亡信號傳導(dǎo)的多種途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]，因此在凋亡研究中是常用的觀察指標(biāo)。已有臨床研究報道[13]Caspase-3的含量與精子濃度、精子活性均呈負(fù)相關(guān)；對錳產(chǎn)生生殖毒性的原理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)生精細(xì)胞Caspase-3表達(dá)、誘發(fā)生精細(xì)胞凋亡可能是機(jī)制之一[14]；也有關(guān)于中藥降低Caspase-3表達(dá)的報道，王志強(qiáng)等[15]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊具有抑制精原細(xì)胞凋亡，降低其Caspase-3的表達(dá)水平的作用。因此本研究也通過Caspase-3的表達(dá)變化來觀察精子凋亡情況，結(jié)果提示下調(diào)Caspase-3表達(dá)水平可能是五子衍宗丸改善精子數(shù)量的機(jī)制之一，既往尚無類似的報道。

在療效方面，觀察過程中4例患者配偶成功受孕，提示少精子癥患者有一定的自然懷孕概率，對于經(jīng)濟(jì)狀況較差而且配偶年齡偏小、精子活力較好的患者，可以建議其采取等待療法。治療后精子總數(shù)、前向運(yùn)動精子百分率明顯改善，尤其是精子總數(shù)整體上已經(jīng)高于參考值標(biāo)準(zhǔn)，但前向運(yùn)動精子百分率未達(dá)到參考值水平，顯示五子衍宗丸對精子數(shù)量的改善優(yōu)于活力。中醫(yī)理論認(rèn)為“陽化氣、陰成形”，精子的數(shù)量是有形物質(zhì)，依賴腎精、腎陰的滋養(yǎng)，而精子的運(yùn)動能力需要陽氣推動，依賴腎陽的溫煦推動和幫助氣化[16,17]，本研究結(jié)果與基礎(chǔ)理論符合?；A(chǔ)研究證實補(bǔ)腎法的生物學(xué)機(jī)制可能是改善性腺、附屬性腺的分泌功能[18,19]，因此理論上五子衍宗丸可以增加精液量，但本次研究并未發(fā)現(xiàn)治療后患者的精液量有顯著增多，可能精液量與禁欲天數(shù)、精神身體狀態(tài)、是否適應(yīng)取精環(huán)境等均有關(guān)系，不是單純的反映附屬性腺的分泌功能。提示在臨床上，除了精液量過多或過少的特殊情況，一般不用過于關(guān)注精液量的變化，因為精液量的影響因素太多，應(yīng)該以一次排精的精子總數(shù)為準(zhǔn)。

將年齡、體質(zhì)量、睪丸體積、精子活力作為影響療效的因素來分析，既往尚未出現(xiàn)采用這種方法的臨床研究報道。本次研究納入的病例介于20～51歲之間，在當(dāng)前的物質(zhì)條件下，男性如果無基礎(chǔ)疾病，其生殖能力可以保持在相對良好的水平，因此本研究未發(fā)現(xiàn)年齡會影響治療效果是可以解釋的。肥胖因素被公認(rèn)可以影響精子質(zhì)量[20,21]，而本研究也發(fā)現(xiàn)肥胖組治療后精子總數(shù)改變并不明顯，推測是肥胖因素導(dǎo)致了精子數(shù)量減少從而抵消了藥物效果，因此在藥物治療的同時，應(yīng)該囑咐肥胖者加強(qiáng)鍛煉減輕體重以提高療效。睪丸體積一定程度上可以體現(xiàn)睪丸的生精功能，小睪丸者出現(xiàn)精子數(shù)量異常的概率也大于睪丸體積正常者，但入組病例中80%睪丸體積正常，本次觀察也并未發(fā)現(xiàn)小睪丸組的治療效果差于睪丸體積正常組，期待以后有大樣本的深入研究。既往對精子數(shù)量和活力的關(guān)系研究甚少，精子數(shù)量主要反映睪丸生精上皮的功能，而精子活力主要體現(xiàn)附睪的功能，理論上兩者應(yīng)該沒有直接關(guān)系，而本研究的入組病例中80%精子活力低，顯示少精多數(shù)伴有弱精，但并未發(fā)現(xiàn)精子活力的差異會影響精子數(shù)量的改善程度。

本研究首次基于Caspase-3表達(dá)研究五子衍宗丸治療少精子癥的機(jī)制，在療效觀察上考慮到了多種可能的影響因素，研究指標(biāo)和方法均有創(chuàng)新性，對臨床有指導(dǎo)意義。然而由于時間和經(jīng)費(fèi)的限制，本次研究病例數(shù)少，期望以后進(jìn)行更大樣本和多中心的研究。