董穎 張雄 龔燕玲 古茂群 曾權(quán)祥

[摘要]目的 檢測(cè)急性髓系白血病（AML）患者Fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-a（CEBPA）基因表達(dá)情況，探討基因突變者臨床特征。方法 選取2015年4月～2017年4月我院的80例AML患者，檢測(cè)骨髓染色體核型及基因突變情況，比較各基因突變患者的臨床特征及預(yù)后相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果 80例AML患者中，染色體核型正常占比43.75%，異常占比56.25%；FLT3-ITD、NPM1、C-KIT-D861V、CEBPA基因突變陽(yáng)性檢出率分別為15.00%、17.50%、7.50%、8.75%，對(duì)應(yīng)正常核型中檢出率分別為25.71%、28.57%、0.00%、20.00%；FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性組骨髓原始細(xì)胞比例顯著高于FLT3-ITD基因突變陰性組（P<0.05），而血紅蛋白（Hb）濃度、免疫表型CD117及人類白細(xì)胞抗原DR（HLA-DR）表達(dá)陽(yáng)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；NPM1基因突變、C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性組與陰性組的骨髓原始細(xì)胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CEBPA基因雙突變的Hb濃度顯著高于陰性組（P<0.05），而骨髓原始細(xì)胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；FLT3-ITD突變陽(yáng)性組的完全緩解（CR）率、1年無(wú)病生存（DFS）率及1年內(nèi)總生存（OS）率均顯著低于陰性組（P<0.05），NPM1突變、C-KIT-D861V突變、CEBPA雙突變陽(yáng)性組與陰性組在CR率、DFS率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但NPM1突變、CEBPA雙突變陽(yáng)性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05），C-KIT-D861V突變陽(yáng)性組的OS率顯著低于陰性組（P<0.05）。結(jié)論 AML患者FLT3、NPM1、C-KIT、CEBPA不同基因突變者顯示出一定程度不同臨床特征，F(xiàn)LT3、C-KIT基因突變者預(yù)后不良，NPM1、CEBPA基因突變者預(yù)后良好。

[關(guān)鍵詞]急性髓系白血?。籉ms樣酪氨酸激酶3基因；核磷蛋白1基因；Ⅲ型酪氨酸激酶基因；髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-a基因；基因突變

[中圖分類號(hào)] R551.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）11（a）-0007-04

Clinical study of gene risk stratification in acute myeloid leukemia

DONG Ying ZHANG Xiong GONG Yan-ling GU Mao-qun ZENG Quan-xiang

Department of Hematology， Maoming People′s Hospital， Guangdong Province， Maoming 525000， China

[Abstract] Objective To detect the expression of Fms-like tyrosine 3 （FLT3）， nucleophosmin 1 （NPM1）， type Ⅲ tyrosine kinase （C-KIT） and myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a （CEBPA） genes in patients with acute myeloid leukemia （AML） and to explore the clinical features of gene mutations. Methods A total of 80 cases of AML patients in our hospital from April 2015 to April 2017 were selected， and the bone marrow karyotype and gene mutations were detected， and the clinical features and prognosis-related indexes of each gene mutation were compared. Results Among 80 AML patients， the proportion of normal karyotype was 43.75%， and the proportion of abnormal karyotype was 56.25%. The positive detection rates of FLT3-ITD， NPM1， C-KIT-D861V and CEBPA mutations were 15.00%， 17.50%， 7.50% and 8.75% respectively， and the detection rates of corresponding normal karyotype were 25.71%， 28.57%， 0.00% and 20.00% respectively. The proportion of bone marrow blasts in FLT3-ITD positive mutation group was significantly higher than that in FLT3-ITD negative mutation group （P<0.05）， but there was no statistically significant difference in hemoglobin （Hb） concentration， immunophenotype CD117 and human leukocyte antigen DR （HLA-DR） positive expression （P>0.05）. There was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， Hb concentration， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation and C-KIT-D861V mutation （P>0.05）. The Hb concentration of double mutation of CEBPA gene of the positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and there was no significant difference in proportion of bone marrow blasts， immunophenotype CD117 and HLA-DR positive expression rate （P>0.05）. The complete remission （CR） rate， 1-year disease-free survival （DFS） rate and overall survival （OS） rate in the FLT3-ITD positive mutation group were significantly lower than those in the negative group （P<0.05）. The difference was not statistically significant in CR rate and DFS rate between the positive group and the negative group of NPM1 mutation， C-KIT-D861V mutation and CEBPA double mutation （P>0.05）， but the OS rate of the NPM1 mutation and CEBPA double mutation positive group was significantly higher than that of the negative group （P<0.05）， and the OS rate of the C-KIT-D861V positive mutation group was significantly lower than that of the negative group （P<0.05）. Conclusion Different mutations of FLT3， NPM1， C-KIT and CEBPA in AML patients show a certain degree of different clinical features. Patients with FLT3 and C-KIT mutations have poor prognosis， and patients with NPM1 and CEBPA mutations have good prognosis.

[Key words] Acute myeloid leukemia； Fms-like tyrosine 3； Nucleophosmin 1； Type Ⅲ tyrosine kinase； Myeloid transcription factor CCAAT enhancer binding protein-a； Gene mutations

急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）指來(lái)源于造血系統(tǒng)髓系原始細(xì)胞惡性增殖的急性白血病，與造血前體細(xì)胞基因突變關(guān)聯(lián)密切[1]。細(xì)胞遺傳學(xué)異常及基因突變?cè)贏ML診斷、危險(xiǎn)分層、預(yù)后評(píng)估中具有重要意義，臨床上，約55% AML患者可檢測(cè)出染色體異常，40%～50% AML患者染色體核型正常，可進(jìn)行基因檢測(cè)進(jìn)一步分層[2]。隨著學(xué)界對(duì)基因與疾病關(guān)系認(rèn)識(shí)的深入、基因測(cè)序技術(shù)及比較基因組學(xué)等技術(shù)發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，AML患者中可鑒別出多種異常基因，基因檢測(cè)對(duì)AML患者診斷、分型及治療均有重要指導(dǎo)意義[3]。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）指南中明確指出Fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）、核磷蛋白1（NPM1）、Ⅲ型酪氨酸激酶（C-KIT）及髓系轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-A（CEBPA）基因突變與AML危險(xiǎn)度分層及預(yù)后的關(guān)系[4]。本研究通過(guò)對(duì)AML患者四項(xiàng)突變基因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行分層，旨在為臨床個(gè)性化治療提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月～2017年4月我院血液內(nèi)科收治的80例AML患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合WHO（2016）造血和淋巴組織腫瘤分類[5]中AML診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡18～75歲，入院前未接受治療，對(duì)檢查、治療及研究均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并胃癌、結(jié)腸癌等其他惡性腫瘤，治療不配合或放棄治療者。80例AML患者中，男44例，女36例；年齡22～75歲，中位年齡52歲；根據(jù)英法美協(xié)作組（FAB）分型[6]，M1型8例，M2型26例，M3型19例，M4型8例，M5型16例，M6型3例。

1.2方法

采集患者骨髓標(biāo)本，通過(guò)骨髓涂片，檢測(cè)患者骨髓原始細(xì)胞比例；經(jīng)過(guò)抗凝、低滲處理、細(xì)胞接種、培養(yǎng)、固定、制片等程序，分析染色體核型；經(jīng)過(guò)抗凝、熒光標(biāo)記、避光孵育、離心、固定等程序，采用流式細(xì)胞儀及相關(guān)應(yīng)用軟件，分析髓系祖細(xì)胞抗原CD117及人類白細(xì)胞抗原DR（HLA-DR）表達(dá)情況；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增FLT3、NPM1、C-KIT及CEBPA基因，檢測(cè)基因突變表達(dá)；采用毛細(xì)管電泳法，通過(guò)基因測(cè)序儀對(duì)突變基因產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，了解各突變基因在AML患者中占比情況。治療方法參考成人AML中國(guó)診療指南[7]，根據(jù)年齡、預(yù)后等級(jí)等給予相應(yīng)治療方案及監(jiān)測(cè)。

1.3觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)納入患者染色體核型及基因突變檢測(cè)結(jié)果，比較不同基因突變陽(yáng)性組和陰性組骨髓原始細(xì)胞比例、血紅蛋白（Hb）水平、CD117級(jí)HLA-DR表達(dá)水平、染色體核型等臨床特征。觀察不同基因突變組一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)劑量化療后的完全緩解（CR）率、1年無(wú)病生存（DFS）率及1年內(nèi)總生存（OS）率，其中所有癥狀、體征完全消失至少4周視為CR，CR到復(fù)發(fā)時(shí)間≥1年視為1年內(nèi)DFS，初診到死亡時(shí)間≥1年視為1年內(nèi)OS[8]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1染色體核型及基因突變檢測(cè)結(jié)果分析

80例AML患者中，染色體核型正常者35例（43.75%），染色體核型異常45例（56.25%）；FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性檢出共12例（15.00%），其中正常核型中檢出率為25.71%，顯著高于異常核型中的6.67%（P<0.05）；NPM1基因突變陽(yáng)性者檢出14例（17.50%），其中正常核型中檢出率為28.57%，顯著高于異常核型中的8.89%（P<0.05）；C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性檢出數(shù)6例（7.50%），其中正常核型中檢出率為0.00%，顯著低于異常核型中的7.50%（P<0.05）；CEBPA基因雙突變陽(yáng)性檢出數(shù)7例（8.75%），其中正常核型中檢出率為20.00%，顯著高于異常核型中的0.00%（P<0.05）（表1）。

2.2 FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性組與陰性組臨床特征的比較

FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性組的骨髓原始細(xì)胞比例顯著高于FLT3-ITD基因突變陰性組（P<0.05），而Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

2.3 NPM1基因突變陽(yáng)性組與陰性組臨床特征的比較

NPM1基因突變陽(yáng)性組與陰性組的骨髓原始細(xì)胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.4 C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性組與陰性組臨床特征的比較

C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性組與陰性組的骨髓原始細(xì)胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

2.5 CEBPA基因雙突變陽(yáng)性組與陰性組臨床特征的比較

CEBPA基因雙突變陽(yáng)性組的Hb濃度顯著高于陰性組（P<0.05），而骨髓原始細(xì)胞比例、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表5）。

2.6不同基因突變組預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的比較

FLT3-ITD突變陽(yáng)性組的CR率、DFS率及OS率均顯著低于陰性組（P<0.05），NPM1突變陽(yáng)性組與陰性組、C-KIT-D861V突變陽(yáng)性組與陰性組、CEBPA雙突變陽(yáng)性組與陰性組的CR率、DFS率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但NPM1突變陽(yáng)性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05），C-KIT-D861V突變陽(yáng)性組的OS率顯著低于陰性組（P<0.05），CEBPA雙突變陽(yáng)性組的OS率顯著高于陰性組（P<0.05）（表6）。

3討論

FLT3基因位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂，在定向造血干細(xì)胞表面優(yōu)先表達(dá)，與造血、免疫系統(tǒng)發(fā)育關(guān)聯(lián)緊密，與其配體（FL）結(jié)合產(chǎn)物可激活多種細(xì)胞信號(hào)通路，調(diào)控造血細(xì)胞增殖及分化。FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列（FLT3-ITD）是常見(jiàn)突變類型，其表達(dá)產(chǎn)物可引起非依賴配體磷酸化，通過(guò)激活多種信號(hào)途徑，賦予細(xì)胞增殖或存活優(yōu)勢(shì)，可造成AML復(fù)發(fā)與難治[9-10]。NPM1主要定位于細(xì)胞核仁中，其表達(dá)蛋白參與中心體復(fù)制、DNA修復(fù)、胞核糖體合成及細(xì)胞凋亡等過(guò)程，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。研究顯示，NPM1基因突變的AML患者對(duì)化療更敏感，預(yù)后較好[11-12]。C-KIT是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成員之一，其基因定位于染色體4q12-13，配體為干細(xì)胞因子，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡，C-KIT-D861V基因突變多發(fā)生于異常染色體核型中，可導(dǎo)致C-KIT受體持續(xù)激活，激活下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，造成細(xì)胞惡性增殖，可增加AML患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，是預(yù)后不良指標(biāo)之一[13-14]。CEBPA基因位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂，在造血系統(tǒng)里僅于髓系細(xì)胞中表達(dá)，其編碼產(chǎn)物為一種維持造血系統(tǒng)粒系分化轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化平衡，其基因突變有單突變及雙突變，單突變對(duì)預(yù)后影響存在爭(zhēng)議，而雙突變被劃分為預(yù)后良好指標(biāo)[15-16]。

染色體核型對(duì)AML患者有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值[17]，本研究對(duì)80例AML患者基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，80例AML患者中，染色體核型正常占比43.75%，染色體核型異常占比56.25%，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果類似[18]。FLT3-ITD、NPM1、CEBPA基因突變多見(jiàn)于正常核型中，C-KIT基因突變主要發(fā)生于異常核型，本研究FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性檢出率15.00%，正常核型中檢出率25.71%，NPM1基因突變陽(yáng)性者檢出率17.50%，正常核型中檢出率28.57%，C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性檢出率7.50%，正常核型中檢出率0.00%，CEBPA基因雙突變陽(yáng)性檢出率8.75%，正常核型中檢出率20.00%；與杜雅哲等[19-20]的報(bào)道類似。FLT3-ITD突變AML患者的骨髓原始細(xì)胞比例較高，CEBPA基因雙突變Hb水平較高[19]，與本研究結(jié)果顯示的FLT3-ITD基因突變陽(yáng)性組骨髓原始細(xì)胞比例高于陰性組，CEBPA基因雙突變陽(yáng)性組Hb濃度顯著高于陰性組研究結(jié)果一致；NPM1基因突變、C-KIT-D861V基因突變陽(yáng)性組與陰性組在骨髓原始細(xì)胞比例、Hb濃度、免疫表型CD117及HLA-DR表達(dá)陽(yáng)性率均未見(jiàn)明顯差異，與報(bào)道[20]中NPM1突變者CD117低表達(dá)等結(jié)果有一定出入，可能與研究樣本有關(guān)。另外，本研究顯示FLT3-ITD突變陽(yáng)性組CR率、DFS率及OS率均低于陰性組，C-KIT-D861V突變陽(yáng)性組OS率顯著低于陰性組，NPM1突變、CEBPA雙突變陽(yáng)性組OS率顯著高于陰性組，與報(bào)道[3，10]中的FLT3-ITD突變、C-KIT-D861V突變預(yù)后不良，而NPM1突變、CEBPA雙突變預(yù)后良好等結(jié)果類似。

綜上所述，AML患者存在基因突變情況，不同基因突變患者在臨床特征上有一定差異，NPM1突變、CEBPA雙突變可作為預(yù)后良好指標(biāo)，F(xiàn)LT3-ITD突變、C-KIT-D861V可作為預(yù)后不良指標(biāo)，通過(guò)檢查四項(xiàng)基因突變情況，可以為臨床預(yù)后判斷及治療提供參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]徐開(kāi)林，曹江.急性髓細(xì)胞白血病基因突變研究現(xiàn)狀及展望[J].國(guó)際輸血及血液學(xué)雜志，2016，39（1）：1-3.

[2]王潔，葉芳，李國(guó)霞，等.急性髓細(xì)胞性白血病基因表達(dá)特點(diǎn)分析[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（1）：13-16.

[3]杜欣，吳萍.急性髓系白血病的基因組分類及預(yù)后分析[J].循證醫(yī)學(xué)，2017，17（2）：81-84.

[4]李兆建，徐俊卿，劉小倩，等.探討中國(guó)急性髓系白血病患者最適預(yù)后分層[J].臨床血液學(xué)雜志，2016，29（7）：571-575.

[5]葉向軍，盧興國(guó).2016年更新版《WHO造血和淋巴組織腫瘤分類》之髓系腫瘤和急性白血病修訂解讀[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2016，34（9）：686-689.

[6]邱少偉，萬(wàn)玉玲，王敏，等.NPM1基因表達(dá)對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞系的影響及其機(jī)制探討[J].中華血液學(xué)雜志，2017， 38（11）：940-943.

[7]中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)白血病淋巴瘤學(xué)組.成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊?guó)診療指南（2017年版）[J].中華血液學(xué)雜志，2017，38（3）：177-182.

[8]連蕓，黃佳瑜，張晶晶，等.老年急性髓系白血病基因突變及臨床意義[J].臨床血液學(xué)雜志，2018，31（1）：14-18.

[9]楊金榮，曾云，于明.急性髓系白血病FLT3基因突變研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2016，45（8）：1104-1107.

[10]黃金文，黃瑞宏，黃國(guó)清.急性髓系白血病患者FLT3檢測(cè)的臨床意義[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，31（5）：110-112.

[11]趙婷，主鴻鵠，王婧，等.早期評(píng)估NPM1突變陽(yáng)性急性髓系白血病患者殘留白血病水平的預(yù)后意義[J].中華血液學(xué)雜志，2017，38（1）：10-16.

[12]周琛，李東，張凡，等.CD13表達(dá)及其與FLT3-ITD、NPM1突變?cè)诩毙运柘蛋籽≈械难芯縖J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，41（4）：398-403.

[13]周翾，李偉京，駱燕輝，等.FLT3、NPM1、WT1、c-KIT基因突變?cè)趦和毙运杓?xì)胞白血病的分布及臨床意義[J].中國(guó)小兒血液與腫瘤雜志，2016，21（3）：147-152.

[14]符爽，胡延平，陳芳，等.伴ETO或CBFβ陽(yáng)性的急性髓細(xì)胞白血病患者c-kit基因突變的檢測(cè)及意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23（11）：1581-1584.

[15]于文青，孫京男，譚業(yè)輝，等.急性髓系白血病CEBPA基因突變的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2015，23（6）：1791-1795.

[16]王舒，張赟翔，眭垮旎，等.正常核型急性髓細(xì)胞白血病中CEBPA基因伴隨突變模式分析[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2017，16（5）：498-503.

[17]高云龍，歐陽(yáng)芬，徐妍凌，等.染色體核型在急性髓系白血病診斷和預(yù)后中的作用探究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2016， 13（9）：1187-1189.

[18]李佳，墻星，張曦，等.急性髓系白血病伴骨髓增殖異常相關(guān)改變的形態(tài)學(xué)及染色體核型研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2017，14（18）：2689-2691.

[19]杜雅哲，蘇龍，李薇，等.正常核型急性髓系白血病CEBPA基因突變患者臨床特征及療效研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2014，22（1）：16-19.

[20]李玲，呂曉東，米瑞華，等.急性髓系白血病患者NPM1、FLT3和C-KIT基因突變的檢測(cè)及其預(yù)后分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（3）：601-606.

（收稿日期：2018-06-12 本文編輯：祁海文）