肖 維， 萬譯文*， 伍遠(yuǎn)安， 楊 霄， 索紋紋

（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長沙410153；2.水產(chǎn)健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000）

敵百蟲、敵敵畏與蠅毒磷均屬于有機磷農(nóng)藥，作為一種殺蟲劑，有機磷農(nóng)藥具有廣譜、高效、低毒、使用方便等特點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)、林業(yè)等方面的防蟲或殺蟲工作（侯文慧，2016；楊立新等，2010；Ragnarsdottir，2000）。 在漁業(yè)飼料中，敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷被作為防腐防蟲劑被使用（韓梅，2012），而農(nóng)藥殘留會隨著飼料進(jìn)入水產(chǎn)品，影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，危害人體健康。因此有必要對漁業(yè)飼料中敵敵畏、敵百蟲及蠅毒磷的殘留檢測建立一個簡便、高準(zhǔn)確度和高靈敏度的檢測方法。

目前，敵百蟲、敵敵畏與蠅毒磷的殘留檢測主要是采用氣相色譜法（王耀等，2010）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（Hu等，2012）。而這兩種方法前處理復(fù)雜，有機溶劑消耗大，在分析的過程中，敵百蟲因其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在高溫中分解成敵敵畏導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確。而采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法時，對極性有機磷選擇性高，同時前處理過程比氣相色譜法或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法簡單，凈化方式可選擇多，因此，建立液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時檢測敵敵畏、敵百蟲及蠅毒磷就較為必要。目前，采用液質(zhì)法對水產(chǎn)品中敵百蟲與敵敵畏殘留進(jìn)行檢測雖有報道（黃冬梅等，2012），但在前處理過程中均采用的C18小柱進(jìn)行固相萃取凈化。

分散型固相萃取（QuEChERS）方法是一種快速、簡單、經(jīng)濟(jì)、高效、抗干擾、安全的樣品前處理方法，其原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)達(dá)到除雜凈化的目的 （劉亞偉，2009；Steven，2005、2004）。 考慮到漁業(yè)飼料中成分比較復(fù)雜，基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)，本文建立一種利用QuEChERS法進(jìn)行樣品凈化，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用來檢測漁業(yè)飼料中的敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 敵百蟲、敵敵畏、蠅毒磷標(biāo)準(zhǔn)品：純度均大于99.9%，美國Sigma公司；乙腈、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯（色譜純），美國天地公司；C18填料，天津科密歐化學(xué)有限公司；中性氧化鋁（分析純），天津科密歐化學(xué)有限公司；硫酸鎂（分析純），天津科密歐化學(xué)有限公司；超純水，美國Milli-Q純水系統(tǒng)制水。

1.2 儀器與設(shè)備 TSQ高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；MX-S旋渦混勻儀（美國Scilogex公司）；超精密電子天平 （日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別稱取一定量的敵百蟲、敵敵畏、蠅毒磷標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容配置成1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用時按照需要用流動相將上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理方法 準(zhǔn)確稱取飼料樣品2.0 g（精確到0.01 g）于離心管中，往離心管中加入含0.1%甲酸的10 mL乙腈，混勻器上混勻2 min后超聲，放入離心機以6000 r/min離心10 min靜置。移取1 mL上層澄清液于10 mL離心管中，加入0.2 g中性氧化鋁、0.5 g無水硫酸鎂及0.5 g C18吸附劑后旋渦混勻，10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22μm濾膜后供LC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱為資生堂CAPCELL PAK C18（100 mm×2.5 mm，2.5 μm）；柱溫為 30 ℃，進(jìn)樣量為20μL，流動相A為甲醇；B為2 mmoL/L的乙酸銨溶液（含0.1%的甲酸）；采用梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用大氣壓電噴霧離子源，正離子模式；毛細(xì)管電壓為3500 V；鞘氣流速為0.17 L/h；輔助氣流量為0.03 L/h；采用ESI+MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行離子監(jiān)測，敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的監(jiān)測離子對、碰撞能量、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 3種化合物的SRM采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇 有機磷農(nóng)藥常用的提取劑有乙腈、正己烷、乙酸乙酯、石油醚等有機溶劑，本文采用這四種不同有機溶劑來對樣品進(jìn)行提取，得到了敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的回收率。由結(jié)果可知，石油醚對上述三種有機磷農(nóng)藥提取的效率低，回收率為40%～60%；采用正己烷提取時，三種待測物均得到了有效的提取，回收率也滿足要求，但是樣品基質(zhì)中含有大量脂肪也溶解于正己烷中，不利于后期的凈化，造成對質(zhì)譜離子源的污染；采用乙腈和乙酸乙酯提取也能取得較好的效果，乙腈能有效提取大多數(shù)農(nóng)殘及藥殘的目標(biāo)物，提取效果好且能有效的沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，乙酸乙酯的提取液中含有少量雜質(zhì)，容易造成乳化現(xiàn)象，不利于凈化過程，造成色譜柱堵塞。因此本文采用甲酸化乙腈作為目標(biāo)物的提取劑，敵百蟲在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，容易分解成敵敵畏而造成敵敵畏的回收率偏高而敵百蟲的回收率偏低，因此在乙腈中加入一定的酸有助于防止敵百蟲的分解。

2.1.2 凈化方式的選擇 目前前處理過程中常用的凈化方式有使用正己烷去脂、固相萃取兩種方式。本文采用QuEChERS進(jìn)行凈化，由于市場上待售的飼料含有蛋白質(zhì)和脂肪，為了得到良好的凈化效果，選擇無水硫酸鎂、中性氧化鋁和C18填料作為吸附劑，中性氧化鋁和C18填料具有良好的除脂能力，而無水硫酸鎂能有效去除色素和水分。為考察這3種吸附劑對目標(biāo)物的吸附情況，在同一濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入1000 mg的3種吸附劑充分混勻1 min，過0.22μm濾膜后測定，發(fā)現(xiàn)C18填料的吸附極強，敵百蟲與敵敵畏的回收率偏低，回收率小于50%；而中性氧化鋁的吸附能力比較弱，可作為凈化劑進(jìn)一步優(yōu)化。根據(jù)飼料提取液中殘留脂肪和色素的含量特點，考察了100～500 mg中性氧化鋁、500～1000 mg無水硫酸鎂及500～1000 mg C18填料按不同比例組合的凈化效果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用0.2 g中性氧化鋁、0.5 g C18填料及0.5 g無水硫酸鎂時，能夠充分吸附樣品中的色素和雜質(zhì)，使溶液得到良好的凈化。采用QuEChERS法凈化時簡單快速、節(jié)約試劑、實驗效率高，回收率也滿足要求。

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化 漁業(yè)飼料中蛋白質(zhì)含量高，色素和雜質(zhì)多，通過前處理凈化降低色譜的本底值后，采用合適的梯度洗脫程序，能使目標(biāo)物得到有效的分離和最佳的質(zhì)譜響應(yīng)信號。同時實驗比較了乙腈-水 （0.1%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、乙腈-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）、甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）四種不同的流動相對目標(biāo)物的分離效果。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用甲醇-乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）作為流動相時，使目標(biāo)物色譜峰峰形尖銳、對稱性好，色譜峰的響應(yīng)強度高。敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的標(biāo)準(zhǔn)溶液SRM色譜圖見圖1。

圖1 敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的SRM圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化 根據(jù)有機磷農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI正離子電離模式對三種有機磷農(nóng)藥混合標(biāo)液進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描分析，得到每個目標(biāo)物的母離子。再選擇豐度最大的二級碎片離子作為定量離子，豐度次強的碎片離子為定性離子。敵百蟲與敵敵畏標(biāo)樣中子離子109的豐度值最大，蠅毒磷標(biāo)樣中子離子307的豐度值最大，因此選用109和307作為定量離子。在使用液質(zhì)法進(jìn)行檢測時，本方法選擇的子離子均符合歐盟657/2002/EC8規(guī)定的識別點要求。

2.4 線性范圍和檢出限 本實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用基質(zhì)加標(biāo)法進(jìn)行，稱取相同基質(zhì)的空白樣品，分別加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成含有敵百蟲、敵敵畏、蠅毒磷的質(zhì)量濃度為2.0、5.0、20、50、100、200 μg/kg樣品，按樣品前處理方法操作，采用外標(biāo)法定量，以待測物的質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標(biāo)，待測物的峰面積比值Y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，由實驗得出的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）見表3。以3倍信噪比為檢出限 （LOD），10倍信噪比為定量限（LOQ），結(jié)合樣品的前處理過程，經(jīng)過樣品添加實驗計算后確定方法的檢出限和定量限。

表3 3種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

結(jié)果表明，敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9992～0.9997，按照本文建立的方法進(jìn)行檢測，這三種有機磷農(nóng)藥的方法LOD均為2.0μg/kg，方法的定量限均為 4.0μg/kg。

2.5 回收率和精密度 本方法采用外標(biāo)法定量，在空白樣品中添加不同濃度的目標(biāo)化合物，按1.3.2中所述條件分別進(jìn)行添加回收率和精密度實驗。在空白樣品中添加4.0、10、50μg/kg三個水平的添加實驗，每個添加水平檢測3次，每次實驗平行測定6次，所得結(jié)果回收率為82.3%～105.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.62%～8.68%，符合國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)的要求，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本文建立的漁業(yè)飼料中敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷的殘留檢測方法，準(zhǔn)確度和精密度較好，滿足對目標(biāo)物的定性和定量的要求，該方法并可為敵百蟲、敵敵畏及蠅毒磷在漁業(yè)飼料中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準(zhǔn)確的分析手段，對食品的安全工作提供了有力的保障。

表4 3種目標(biāo)物在空白樣品中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs，n=6）