胰腺癌起病隱匿、進(jìn)展迅速，位列惡性腫瘤相關(guān)死亡原因的第4位，轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者中位生存期僅4～6個(gè)月。吉西他濱(gemcitabine，GEM)作為一線化療藥物，僅僅能延長1.5個(gè)月的中位生存時(shí)間，而以GEM為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療也未能明顯改善胰腺癌患者預(yù)后，反而引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此優(yōu)化胰腺癌的化療方案迫在眉睫。二甲雙胍(metformin, MET)是臨床上治療2型糖尿病的一線藥物，其通過抑制肝糖異生、延緩胃腸道對葡萄糖的攝取以及增加外周對葡萄糖的利用降低血糖。近些年MET因其抗腫瘤作用越來越被重視。本研究觀察MET聯(lián)合GEM對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長的影響，初步探討其可能機(jī)制。

一、材料與方法

1．材料：4～5周齡的Balb/c小鼠20只，體重15～16 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。 人胰腺癌細(xì)胞株(cystic fibrosis pancreatic duct adenocarcinoma-1，CFPAC-1)由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液研究所饋贈(zèng)。MET粉購于美國Sigma-Aldrich公司；GEM購于日本TCI公司。兔抗人caspase3一抗購自Abcam公司，兔抗人Bcl-xl、survivin、Bax一抗和鼠抗人β-actin一抗以及羊抗兔、羊抗鼠二抗均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

2．移植瘤模型制備：取對數(shù)生長期的CFPAC-1細(xì)胞，測定細(xì)胞活性>95%，調(diào)整密度至1×107/ml。取0.2 ml細(xì)胞懸液(約2×106個(gè))注射于裸鼠的左前肢腋窩皮下，成瘤后按數(shù)字表法隨機(jī)分成4組：對照組，腹腔內(nèi)注射生理鹽水，1次/d；MET組，腹腔內(nèi)注射MET 200 mg·kg-1·d-1，1次/d；GEM組，腹腔內(nèi)注射GEM 50 mg·kg-1·d-1，2次/周；MET+GEM組，腹腔內(nèi)同時(shí)注射MET 200 mg·kg-1·d-1及GEM 50 mg·kg-1·d-1。每周監(jiān)測各組裸鼠體重及皮下移植瘤體積的變化，繪制生長曲線。4周后頸椎脫位法處死荷瘤裸鼠，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2。稱取移植瘤重量，抑瘤率=(對照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對照組瘤重×100%。

3．瘤組織凋亡相關(guān)分子Bcl-xl、Survivin、Bax、caspase3 mRNA表達(dá)的檢測：提取各組移植瘤組織總RNA，檢測RNA純度及濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。引物序列見表1，由金唯智公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外成像系統(tǒng)觀察、拍照并分析圖像。

表1 PCR引物列表

4．瘤組織Bcl-xl、Survivin、Bax、caspase3蛋白表達(dá)的檢測： 取各組新鮮瘤組織50 mg，加入0.5 ml RIPA液提取組織總蛋白，BCA法定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-xl、Survivin、Bax、caspase3蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗人Bcl-xl、survivin、Bax、caspase3一抗和鼠抗人β-actin一抗工作濃度按照說明書推薦的參數(shù)稀釋，ECL液顯影。應(yīng)用Image J軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比作為蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

取甲醛固定的移植瘤組織，常規(guī)石蠟包埋、切片，采用S-P法行免疫組織化學(xué)染色檢測caspase3蛋白表達(dá)，caspase3一抗工作濃度為1∶1 000。以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕色至棕褐色微細(xì)顆粒為caspase3陽性，主要表達(dá)于胞質(zhì)，少數(shù)表達(dá)于胞核或核膜。高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)以上視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，即為陽性細(xì)胞指數(shù)。

二、結(jié)果

1．移植瘤體積、重量及抑瘤率：對照組、MET組、GEM組以及MET+GEM組移植瘤體積分別為(0.840±0.082)、(0.583±0.029)、(0.407±0.029)、(0.224±0.044)cm3；瘤重分別為(0.910±0.100)、(0.647±0.044)、(0.494g±0.118)、(0.256g±0.0400)g；抑瘤率分別為(28.90±2.23)%、(45.71±3.20)%和(71.87±5.04)%。MET組及GEM組瘤體積均較對照組減小，瘤重均較對照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，MET+GEM組移植瘤體積及瘤重均較單藥組顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖1)。

圖1 對照組(1A)、MET組(1B)、GEM組(1C)、MET+GEM組(1D)移植瘤照片

2．移植瘤組織凋亡相關(guān)分子的mRNA表達(dá)：MET組、GEM組以及MET+GEM組Bcl-xl、Survivin mRNA表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，而Bax、caspase3 mRNA的表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，MET+GEM組較單藥組的這一作用更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，表2、圖2)。

組別Bcl-xlBaxSurvivincaspase-3對照組0.77±0.050.22±0.020.69±0.040.18±0.01MET組0.41±0.03a0.59±0.03a0.44±0.04a0.50±0.03aGEM組0.52±0.03a0.54±0.02a0.40±0.03a0.55±0.02aMET+GEM組0.17±0.02ab0.86±0.03ab0.15±0.01ab0.72±0.05ab

注：與對照組比較，aP<0.05，與單藥組比較，bP<0.05

圖2 對照組(1)、MET組(2)、GEM組(3)、MET+GEM組(4)移植瘤組織凋亡相關(guān)分子mRNA表達(dá)

3．移植瘤組織凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá)：蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，MET組、GEM組以及MET+GEM組Bcl-xl、Survivin蛋白表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，而Bax、caspase3蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，且MET+GEM組較單藥組變化更顯著(表3、圖3)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MET組、GEM組以及MET+GEM組移植瘤組織caspase3陽性細(xì)胞指數(shù)分別為(16.23±2.24)%、(17.39±3.11)%、(36.98±2.87)%， 均較對照組(7.87±3.34)%明顯升高，且MET+GEM組較単藥組升高更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05，圖4)。

組別Bcl-xlBaxSurvivincaspase3對照組0.50±0.030.13±0.010.69±0.050.11±0.02MET組0.19±0.01a0.29±0.02a0.43±0.03a0.31±0.02aGEM組0.10±0.01a0.36±0.02a0.44±0.02a0.34±0.04aMET+GEM組0.08±0.01ab0.64±0.04ab0.18±0.02ab0.74±0.05ab

注：與對照組比較，aP<0.05，與單藥組比較，bP<0.05

圖3 對照組(1)、MET組(2)、GEM組(3)以及MET+GEM組(4)移植瘤組織凋亡相關(guān)分子的蛋白表達(dá)

圖4 對照組(4A)；MET組(4B)；GEM組(4C)；MET+GEM組(4D)移植瘤組織caspase3的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

討論2005年Evans等[1]首次發(fā)表MET的抗腫瘤作用后，關(guān)于MET與惡性腫瘤的臨床研究屢見報(bào)道。多項(xiàng)薈萃分析表明，2型糖尿病患者應(yīng)用MET治療后，多種惡性腫瘤包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌的發(fā)生率及病死率顯著下降[2]，且發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者的生存時(shí)間延長[3]。體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，MET能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移，抑制裸鼠移植瘤的生長[4-5]。

賀志龍和許春芳[6]體外實(shí)驗(yàn)證明， MET聯(lián)合GEM對人胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1增殖具有協(xié)同抑制作用，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因家族在凋亡過程中起著十分重要的作用，其中Bcl-xl是細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax是細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因。研究發(fā)現(xiàn)超過半數(shù)的惡性腫瘤伴有Bcl-xl的過度表達(dá)[7]。Bax可破壞線粒體外膜完整性， 使細(xì)胞色素C等釋放進(jìn)入胞質(zhì)，最后激活凋亡途徑的最終效應(yīng)因子caspase3引起染色體斷裂、細(xì)胞凋亡。而Bcl-xl蛋白通過阻止Bax對線粒體外膜的破壞從而抑制細(xì)胞色素C的釋放。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)的成員之一，它被認(rèn)為是一種節(jié)點(diǎn)蛋白， 既能夠抑制凋亡也能調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂。一些學(xué)者正嘗試運(yùn)用Bcl-2、IAP家族等基因重新激活細(xì)胞凋亡從而消除癌細(xì)胞[8]。 本研究結(jié)果顯示，MET組、GEM組和MET、GEM聯(lián)合組移植瘤體積及瘤重都較對照組明顯減小，其中聯(lián)合組作用最顯著?；蚣暗鞍姿綑z測顯示，MET組、GEM組和MET+GEM組Bcl-xl、Survivin表達(dá)下調(diào)，而Bax、caspase3表達(dá)上調(diào)，其中聯(lián)合組下調(diào)或者上調(diào)更為明顯，提示MET協(xié)同GEM調(diào)控上述凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

多項(xiàng)回顧性研究表明，MET給胰腺癌患者帶來生存獲益[9-10]。 一項(xiàng)包含4個(gè)獨(dú)立研究共1 429例胰腺癌合并糖尿病患者的薈萃分析表明[11]，相對于不服用MET的患者， 服用組患者生存期延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.80，95%CI0.62～1.03)。然而2010年至2014年間一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的2期臨床試驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)安慰劑組與MET組之間的明顯生存時(shí)間差異(7.6個(gè)月比6.8個(gè)月，HR=1.056，95%CI0.72～1.55)[12]。MET是否能夠提高GEM的化療效果和改善患者預(yù)后，以及是否存在其他的作用機(jī)制，仍然值得進(jìn)一步探討。