沈飚黃雷葉凌胡興娟*滕躍王忠發(fā)張杰

1.舟山出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心 浙江舟山 316000；2舟山市岱山縣疾病預(yù)防控制中心

發(fā)熱伴血小板減少綜合征 （Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome，SFTS）是由新型布尼亞病毒也稱發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）感染所致的新發(fā)傳染病，SFTSV廣泛分布于中國中東部、韓國與日本[1]。潛伏期一般為 7～14 d，平均 9 d，其發(fā)病特點為發(fā)病急，病情進展快，臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、頭痛、肌肉酸痛、局部淋巴結(jié)腫大、消化道癥狀及血小板及白細(xì)胞減少，轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶升高。部分病例可出現(xiàn)出血癥狀，少數(shù)重癥病例可因多臟器功能損傷救治無效而死亡，平均病死率約 10%～30%，在日本韓國則高達(dá) 50%[2，3]。2011 年 6月舟山市首例發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例被確診[4]，此后每年都有新病例被確診，發(fā)病人數(shù)與病死率都呈不斷上升趨勢，另有30%左右的臨床疑似病例得不到病原學(xué)確診，是否還有與SFTSV類似的病毒存在引起了我們的關(guān)注。當(dāng)前國際上與SFTSV高度相關(guān)的類SFTSV病毒有來自美國的腹地病毒（Heartland virus，HRTV）、澳大利亞的獵人島病毒（Hunter Island virus，HIGV）、印度的馬爾索爾病毒（Malsoor virus，MalsoorV）及新疆的古爾圖病毒（Guertu virus，GuertuV）[5]，上述4種病毒基因結(jié)構(gòu)與SFTSV相同，均有L、M、S的3個特異性基因節(jié)段，與SFTSV的基因序列相似度分別是：61.2%、52.0%、56.4%與75.2%。上述5種病毒基因編碼的蛋白抗原也有一定得交叉反應(yīng)，除了SFTSV與HRTV能感染人引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征之外其他3種病毒未見致病性報道，但并不代表著這些類SFTSV不具有潛在的危險性[6，7]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 疑似病人血清采集與處理

為適當(dāng)擴大檢測范圍，SFTS疑似病例的確定參照《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南（2010版）附件2》執(zhí)行。2014—2017年共采集臨床SFTS疑似病例180例，男性78例，女性102例，年齡分布12～88歲，平均63.31歲±14.51歲。病人入院后采集清晨空腹靜脈血5 mL，分離血清后以每管0.5 mL分裝后置-80℃超低溫冰箱保存。

實時熒光定量RT-PCR特異度驗證用的SFTSV陰性血清由體檢正常的嬰幼兒血清與臨床常見的其他血液病毒陽性血清：乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）及登革熱病毒（DENV）組成，SFTSV陽性血清由舟山市婦幼保健院、舟山醫(yī)院、岱山縣疾病控制中心提供。

1.1.2 傳播媒介采集與處理

1.1.2.1 鼠

在寧波舟山港域內(nèi)每年有發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例確診的象山縣、寧?？h與岱山縣的患者居住地周圍野外山坡地（疫點）用鼠籠或鼠夾捕捉老鼠并進行鼠種分類登記，在生物安全柜內(nèi)解剖老鼠，取鼠肺保存于-80℃超低溫冰箱，取1 g左右鼠肺樣本到2 mL EP管，加1 mL動物細(xì)胞培養(yǎng)液（MEM）在混合球磨儀（型號MM400）中低溫研磨2次（50 Hz 2 min/次），然后8 000 rpm低溫離心5 min，取上清200 μL提取RNA，上清為熒光RT-PCR檢測用模板。余下的300 μL保存于-80℃作為復(fù)檢與病毒分離備用樣本。

1.1.2.2 蜱

游離蜱選用布旗法采集野外草地游離未吸血蜱，回實驗室解剖顯微鏡下分類，10只蜱為一組。

1.1.2.3 螨

游離螨蟲捕捉參照于娟等報道的小黑板方法[8]，選晴天上午10時至下午3時在患者居住地周圍草地上放小黑板若干塊，10～20 min取回小黑板，觀察正反面，如有緩慢爬行的游離螨，即用濕毛筆挑入EP管內(nèi)帶回實驗室倒置顯微鏡下鑒定、計數(shù)、備用。寄生螨選疫區(qū)患皮膚病的貓與狗，用棉簽刮取貓耳內(nèi)分泌物放入EP管內(nèi)或用手術(shù)刀片刮取狗耳皮炎處皮屑放入EP管內(nèi)，在實驗室倒置顯微鏡下鑒定、計數(shù)、分組，按每組100只螨樣本放入2 mL EP管，用25%酒精清洗消毒1 min，加1 mL MEM渦旋清洗反復(fù)3次，8 000 rpm 5 min去上清。加500 μL MEM在MM400混合球磨儀中低溫下進行研磨2次（50 Hz 2 min/次），8 000 rpm低溫離心5 min取上清200 μL提取RNA，上清為熒光RT-PCR檢測用模板。余下300 μL保存于-80℃作為復(fù)檢與病毒分離備用樣本。

1.1.3 熒光定量RT-PCR的引物與探針設(shè)計與合成

選用美國國家生物信息中心（NCBI）靶基因核苷酸序列搜尋軟件 （Nucleotide）、Blast比對分析軟件、美國綜合DNA技術(shù)公司（IDTDNA）網(wǎng)上引物設(shè)計軟件，進行發(fā)熱伴血小板減少綜合征相關(guān)病毒的引物、探針設(shè)計，設(shè)計的引物、探針序列經(jīng)Blast比對驗證合格的引物、探針，選擇綜合指標(biāo)最優(yōu)的序列提交到TaKaRa生物工程公司合成與標(biāo)記，5’標(biāo)記FAM或HEX發(fā)光基團，3’標(biāo)記TAMARA或BHQ1淬滅基團，見表1。

1.1.4 5種病毒陽性質(zhì)粒構(gòu)建

從Nucleotide軟件上分別下載5種病毒靶基因序列，經(jīng)與熒光RT-PCR匹配的前引物至后引物連續(xù)序列作為5種病毒陽性質(zhì)粒構(gòu)建序列，經(jīng)Blast特異度比對分析合格后，把上述5段陽性質(zhì)粒序列提交到TaKaRa生物工程公司合構(gòu)建質(zhì)粒。上述5個陽性質(zhì)?？捎糜趯崟r熒光定量RT-PCR的陽性對照、定量標(biāo)準(zhǔn)參照、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等。5種病毒陽性質(zhì)粒序列見表2。

表1 SFTS相關(guān)的五種病毒實時熒光定量RT-PCR檢測引物探針序列

表2 發(fā)熱伴血小板減少綜合征相關(guān)的5種病毒構(gòu)建的陽性質(zhì)粒序列

1.1.5 主要試劑

一步法實時熒光定量RT-PCR試劑盒（RR064A）、一步法RT-PCR試劑盒（RR055A）、PCR試劑盒（RR 902A）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（6210A）均購自寶生物工程（大連）有限公司，病毒RNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司74104）、酶聯(lián)免疫SFTSV抗體檢測試劑盒（無錫鑫連鑫生物醫(yī)學(xué)科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 5種病毒實時熒光定量RT-PCR快速檢測體系構(gòu)建

熒光RT-PCR擴增體系與反應(yīng)條件、引物與探針配比與濃度的優(yōu)化，然后對建立的熒光RT-PCR的靈敏度、特異度、重復(fù)性、擴增曲線形態(tài)、反應(yīng)所需時間等重要指標(biāo)進行測試、比對與評估。

1.2.2 病毒載量檢測體系構(gòu)建

定量標(biāo)準(zhǔn)品制備：根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司構(gòu)建提交的5種病毒的陽性質(zhì)粒濃度數(shù)據(jù)換算成拷貝數(shù)，換算公式：（每微升質(zhì)粒質(zhì)量×10-9/660×質(zhì)粒堿基長度）×6.02×1023=拷貝數(shù)/μL。 經(jīng)計算 5種病毒的陽性質(zhì)粒原液的每微升拷貝數(shù)見表3。

表3 5種病毒的陽性質(zhì)粒原液的每微升拷貝數(shù)

1.2.3 熒光定量RT-PCR檢測陽性樣本的鑒定

1.2.3.1 病毒L、M、S 3個特異性基檢測鑒定

5種病毒遺傳基因結(jié)構(gòu)相同均含有L、M、S 3個特異性基因，所有實時熒光RT-PCR陽性樣本須經(jīng)L、M、S 3個特異性基因檢測，3個特異性基因檢測陽性該樣本確認(rèn)為陽性。3個特異性基因檢測方法采用巢式PCR，引物選用參考文獻[9]中的引物。

1.2.3.2 病毒分離培養(yǎng)鑒定

符合病毒分離的陽性樣本（距發(fā)病時間5d以內(nèi)、CT值＜35的血清）用非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）進行病毒分離培養(yǎng)，具體步驟按胡逢蛟等[10]報道的方法執(zhí)行，取樣本 100 μL，加 10 μL 青霉素和鏈霉素，使雙抗終濃度為1 000 U/mL，4℃放置4 h。將生長至70%～80%的單層Vero細(xì)胞用維持液洗滌3次后加入雙抗處理過的血清樣本及3 mL細(xì)胞維持液。置于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，次日棄去液體，并用細(xì)胞維持液洗一遍，再加入3 mL細(xì)胞維持液放置于35℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每隔3 d換一次液，并逐日觀察細(xì)胞病變 （CPE）至++++時取上清作病毒鑒定，無細(xì)胞病變（CPE）的樣本繼續(xù)培養(yǎng)至第14 d，陰性樣本盲傳3代，第3代仍未出現(xiàn)CPE者進行間接熒光免疫法（IFA）與PCR檢測，有陽性反應(yīng)的繼續(xù)傳代，無陽性反應(yīng)的樣本作陰性處理。

1.2.3.3 病毒序列測定比對分析及聚類進化樹構(gòu)建

選擇具有代表性陽性樣本進行序列測定分析及聚類進化樹構(gòu)建。運用MEGA5.2軟件中的Clustal W進行序列比對，基于Kimura-2模型構(gòu)建NJ（Neighbor-Joining）系統(tǒng)進化樹，并計算序列之間的遺傳距離?；蚍中蛥⒄諒?fù)旦大學(xué)付永鋒博士的方法[11]。

1.2.4 實驗質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗樣本采集、檢測、診斷、病例分類等標(biāo)準(zhǔn)按《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南，2010版》執(zhí)行[12]。實驗室個人防護、實驗廢棄物處置、防護設(shè)備要求等生物安全措施按 《病原微生物實驗室生物安全管理條例》執(zhí)行[13]。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計參照陳坤主編的《臨床流行病學(xué)》[14]。

1.2.5 倫理學(xué)問題

采樣、檢測與數(shù)據(jù)分析專業(yè)工作者應(yīng)對被調(diào)查者的所有信息及病情進行保密。

2 結(jié)果

2.1 5種病毒實時熒光定量RT-PCR與陽性質(zhì)粒驗證結(jié)果

2.1.1 實時熒光定量RT-PCR擴增體系與反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

熒光 RT-PCR 擴增體系為 25 μL（064 A），優(yōu)化后各反應(yīng)物的體積為：RT-PCR緩沖液12.5 μL；校正液 （ROX）0.5 μL；Taq 酶和逆轉(zhuǎn)錄酶各 0.5 μL（5單位/μL）；10 μmol/L 上游引物 0.5 μL；10 μmol/L 下游 引 物 0.5 μL；5 μmol/L 熒 光 探 針 0.5 μmol/L（TaqMan）；Rnase Free 水 4.5 μL；模板 5 μL。反應(yīng)條件（FAST）：逆轉(zhuǎn)錄：42.0℃ 5 min、95℃ 10 s ；PCR：95℃ 1 s、60℃ 20 s，40 個循環(huán)；60℃在 FAM 或 VIC通道采集熒光信號。在上述條件下HRTV、SFTSV、HIGV、MalsoorV與GuertuV優(yōu)化后的熒光RT-PCR用于以下不同濃度的陽性質(zhì)粒檢測，檢測結(jié)果顯示本研究建立的方法均能用于HRTV、SFTSV、HIGV、MalsoorV與GuertuV病毒核酸檢測，并能獲得有規(guī)律的典型的擴增曲線。HRTV、SFTSV擴增曲線見參考文獻[15]報道，HIGV、MalsoorV與GuertuV的擴增曲線見圖1。

圖1 HIGV、MalsoorV與GuertuV的擴增效果與重復(fù)性

2.1.2 實時熒光定量RT-PCR檢測體系的靈敏度測試結(jié)果

將構(gòu)建的5種病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從5×107拷貝/μL稀釋至 5×100拷貝/μL共 8個濃度，用上述熒光RT-PCR快速檢測體系分別測其定靈敏度，測定結(jié)果是：SFTSV、MalsoorV、GuertuV 均達(dá)到 5×100拷貝/μL，HRTV、HIGV 達(dá)到 5×101拷貝/μL。

2.1.3 實時熒光定量RT-PCR的重復(fù)性測試結(jié)果

將構(gòu)建的5種病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從5×107拷貝/μL 稀釋至 5×101拷貝/μL 共 7個濃度，每個濃度重復(fù)測試3次，計算重復(fù)測試樣本的平均CT值、標(biāo)準(zhǔn)差與變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 熒光RT-PCR對5種質(zhì)粒7個濃度的重復(fù)性測試結(jié)果

2.1.4 實時熒光定量RT-PCR的特異度測試結(jié)果

取臨床常見的血液病毒陽性血清、體檢正常的成人血清、SFTSV確診陽性血清各30份，以體檢正常的嬰幼兒混合血清為5種病毒陰性對照，以5種病毒陽性質(zhì)粒為陽性對照。用上述5種實時熒光定量RT-PCR分別檢測驗證，驗證結(jié)果：陽性對照均為陽性，陰性對照均為陰性，在90份驗證血清中未檢測到 HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4 種病毒，但在30份SFTSV確診陽性血清中均能檢測到陽性結(jié)果。

2.2 臨床疑似病例血清中5種病毒監(jiān)測結(jié)果及陽性病人島嶼分布

2014—2017年共收集臨床疑似病例急性期血清180份，用上述實時熒光定量RT-PCR檢測試劑對 5種病毒進行檢測， HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4種病毒的檢測結(jié)果，除了陽性對照（質(zhì)粒）獲得陽性結(jié)果外，180份血清樣本與陰性對照均為陰性。SFTSV的檢測結(jié)果：陽性92份、陰性88份，SFTSV的檢出陽性率為51.11%（92/180）。92例SFTS確診病人分布在岱山本島有69例、長涂島有12例、衢山島2例、大貓摘箬山島5例、金塘島2例、枸杞島2例，見圖2。

圖2 92例SFTS確診病例在寧波舟山港域內(nèi)分布（圖中有黑點的島嶼上）

2.3 傳播媒介中5種病毒監(jiān)測結(jié)果

疫區(qū)鼠肺283份，每個鼠肺為一組。疫區(qū)恙螨605只，每100只為一組共分6組。疫區(qū)蜱200只，每10只為一組共分20組。實時熒光定量RT-PCR檢測上 述 樣 本 中 的 SFTSV、HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 5種病毒核酸RNA，檢測結(jié)果均為陰性。

2.4 陽性樣本特異性基因鑒定結(jié)果

SFTSV具有L、M、S 3個特異性基因節(jié)段，用巢式PCR對92份陽性血清進行L、M、S 3個特異性基因節(jié)段檢測確認(rèn)，檢測結(jié)果顯示92份均能檢測到SFTSV 3個特異性基因，因此可以確認(rèn)上述92例臨床疑似病人均為SFTSV病毒感染所致。SFTSV的3個特異性基因（M、S、L）的巢式PCR擴增產(chǎn)物長度分別是：420 bp、601 bp、1 020 bp，見圖 3。

圖3 巢式PCR鑒定SFTS病毒特異性基因長度

2.5 陽性樣本病毒分離鑒定結(jié)果

在92份陽性血清中挑選適合病毒分離（距發(fā)病時間5 d以內(nèi)、CT值＜35）的樣本65份進行病毒分離，在65份血清樣本中分離到SFTSV 47株，分離陽性率為72.31%（47/65）。SFTSV致Vero細(xì)胞病變形態(tài)，見圖4。

圖4 SFTSV致Vero細(xì)胞病變形態(tài)

2.6 病毒基因序列測定分析與聚類進化樹構(gòu)建

47株SFTSV可分為A與B兩個基因型，A基因型占 25.53%（12/47）、B 基因型占 74.47%（35/47），A與B兩基因距離在0.046～0.054，由于同一基因型內(nèi)的序列聚類差異原因，B基因型分成2個進化分支，A基因型可分為3個進化分支，5個進化分支之間的基因距離0.019～0.038。B基因型中第一分支占94.29%（33/35），主要分布在岱山本島，分支內(nèi)33株病毒之間的同源性均≥99.5%，與基因庫中同源性最高的是 Zhejiang/01/2011（KJ597832）毒株，序列同源性為99.99%，是B基因型中一支相對獨立的進化系統(tǒng)被稱為舟山系[11]。B基因型中第二分支占5.71%（2/35），僅分布在嵊泗枸杞島，分支內(nèi)2株病毒的同源性99.99%，與基因庫中同源性最高的是日本毒株SPL053A（AB985523）序列同源性是99.71%。A基因型中第一分支占41.67%（5/12），主要分布在岱山長涂島，分支內(nèi)5株病毒株間的序列同源性均≥99.6%，與基因庫中同源性最高的是韓國毒株CB3（KY789440），序列同源性是99.08%。A基因型中第二分支占41.67%（5/12），主要分布在定海的大貓摘箬山島，分支內(nèi)毒株間的序列同源性均≥99.50%，與基因庫中同源性最高的是寧波毒株NB34（KR698327），序列同源性是99.54%。A基因型中第三分支占16.66%（2/12），僅分布在岱山大衢島，分支內(nèi)的2株病毒同源性99.99%，與基因庫中同源性最高的是江蘇毒株JS2011-109（KC505140），序列同源性是 99.71%。寧波舟山港域內(nèi)的SFTSV聚類進化樹見圖5。

圖5 2014—2017年47株SFTS病毒S基因型與系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 討論

本次監(jiān)測用于 SFTSV、HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 5種病毒檢測的實時熒光定量RT-PCR方法經(jīng)過靈敏度、重復(fù)性、特異性及擴增曲線等重要指標(biāo)驗證均取得比較滿意的結(jié)果，唯一欠缺的是未能獲得 HRTV、HIGV、MalsoorV、GuertuV 4 種病毒的陽性參照樣本，因此只能選用特異性的陽性質(zhì)粒取代，根據(jù)既往的工作經(jīng)驗應(yīng)用陽性質(zhì)粒對檢測結(jié)果的可靠性不會造成較大的影響。通過對2014—2017年舟山各醫(yī)院上送的180份臨床SFTS疑似病例監(jiān)測結(jié)果顯示：除SFTSV外其余4種病毒均為陰性，SFTSV核酸的檢出率為51.11%（92/180）稍為偏低的原因是與送檢樣本關(guān)系密切，本次監(jiān)測因考慮到其他4種病毒的存在可能，只要有發(fā)熱、血小板白細(xì)胞降低、轉(zhuǎn)氨酶升高、不分發(fā)病季節(jié)與病人年齡均作為SFTS疑似病例樣本收集，若是典型樣本的檢出率則可明顯提高。用上述實時熒光定量RT-PCR對1 088份傳播媒介的檢測結(jié)果全部陰性與浙江省疾控中心和山東大學(xué)結(jié)果一致[16]。本地沒有Guertu病毒宿主-長尾黃鼠與草原革蜱[17]，HRTV、HIGV與MalsoorV病毒分布于美國、澳大利亞與印度，上述情況可能是檢測陰性的主要原因。從上述監(jiān)測結(jié)果來分析，當(dāng)前寧波舟山港域區(qū)內(nèi)發(fā)熱伴血小板綜合征病原體為單一的SFTSV，未見有其他類SFTSV傳入。

復(fù)旦大學(xué)的付永鋒博士根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析表明當(dāng)前的SFTSV可以分為6種基因型，不同基因型之間的基因距離為 0.035～0.062。F、A、D基因型在中國大陸地區(qū)占主導(dǎo)地位，E基因型僅在江蘇和山東被發(fā)現(xiàn)，B基因型在日本和韓國占主導(dǎo)地位，但是沒有在中國大陸被發(fā)現(xiàn)[11]。當(dāng)前流行于寧波舟山港域內(nèi)的B基因型病毒是本地的主要流行病毒株，具有相對獨立的遺傳特征與流行于日韓的B基因型病毒基因序列有較大的差異，基因距離為0.038。因此寧波舟山港域內(nèi)臨床病例在發(fā)病率與病死率、感染發(fā)生時間與感染年齡、虛弱與腹脹等臨床癥狀也與國內(nèi)其他地區(qū)有一定差異。另一個遺傳進化特征是每個進化分支在各島內(nèi)聚集比較明顯，如B基因中第一分支的33株病毒聚集于岱山本島；B基因中第二分支的2株病毒聚集于靠近公海的枸杞島；A基因第一分支的5株病毒聚集于岱山島、長涂島；A基因中第二分支5株病毒聚集于緊靠寧波的大毛摘箬山島；A基因中第三分支2株病毒聚集于大衢島；可能是通過海鳥傳播，也可能是通過外輪修理（長涂島上有大型船廠與韓國外輪關(guān)系密切）或通過大宗農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)運中的傳播媒介傳播?？傊甋FTSV的傳播途徑還不十分明確，因此今后需嚴(yán)密關(guān)注重視國際上新發(fā)傳染病病原體的檢驗被檢疫工作。