李躍文，朱 斌，劉志強(qiáng)，王博龍

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川陳皮素潛在藥效靶標(biāo)預(yù)測(cè)及多維藥理作用分析

李躍文，朱 斌，劉志強(qiáng)，*王博龍

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西，宜春 336000）

預(yù)測(cè)中藥活性成分川陳皮素的潛在靶標(biāo)并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，探討其多維藥理作用。運(yùn)用反向分子對(duì)接服務(wù)器PharmMapper將川陳皮素與2241個(gè)人類蛋白靶標(biāo)分別對(duì)接，選取Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白，采用Systemsdock Web Site平臺(tái)對(duì)具有疾病治療價(jià)值的主要靶蛋白進(jìn)行正向分子對(duì)接驗(yàn)證。川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白（Seprase）、網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4 recoptor)、組織蛋白酶L2（CathepsinL2）3個(gè)靶蛋白結(jié)合較好，對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為5.215、5.227、6.090。靶蛋白藥效團(tuán)模型與川陳皮素分子特征一致，分子對(duì)接顯示川陳皮素與靶蛋白核心氨基酸有相互作用。川陳皮素與Seprase、Reticulon-4 recoptor、CathepsinL2 3個(gè)重要靶蛋白結(jié)合強(qiáng)度較好，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等藥理作用。

川陳皮素；反向分子對(duì)接；藥效團(tuán)模型；靶蛋白

中藥活性成分的潛在生物靶標(biāo)預(yù)測(cè)是一項(xiàng)艱難的任務(wù)，為改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法提高工作效率，科學(xué)家提出了一系列經(jīng)典的方案，比如分子對(duì)接（reverse docking）。分子對(duì)接來(lái)源于1894年德國(guó)化學(xué)家Fisher提出的“鎖-匙（Lock and Key Theory）”學(xué)說(shuō)，就是把來(lái)源自三維數(shù)據(jù)庫(kù)的配體分子放置到受體大分子的活性位點(diǎn)中，預(yù)測(cè)配體分子跟受體結(jié)合構(gòu)象及作用能的過(guò)程。分子對(duì)接包括反向分子對(duì)接和正向分子對(duì)接。反向分子對(duì)接是用小分子化合物包括天然產(chǎn)物、先導(dǎo)化合物或化學(xué)合成物為探針，在已知結(jié)構(gòu)的靶點(diǎn)三維數(shù)據(jù)庫(kù)里尋找能夠和它結(jié)合的生物大分子，通過(guò)空間與能量匹配互相識(shí)別形成靶標(biāo)-配體分子復(fù)合物，在此程度上去預(yù)測(cè)小分子天然產(chǎn)物、先導(dǎo)化合物或化學(xué)合成物的潛在靶點(diǎn)[1-2]。正向分子對(duì)接則是運(yùn)用大批的小分子活性化合物跟靶標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)接，篩選出能夠與靶標(biāo)蛋白相結(jié)合的活性化合物[3]。在INVDOCK、TarFisDock和PharmMapper等計(jì)算機(jī)工具為用戶所熟知并得到應(yīng)用之后，反向分子對(duì)接便捷的預(yù)測(cè)能力為發(fā)現(xiàn)潛在藥物靶點(diǎn)提供了幫助，現(xiàn)如今已經(jīng)變成靶點(diǎn)識(shí)別中無(wú)法代替的技術(shù)工具。

PharmMapper在線服務(wù)器是根據(jù)“反向”藥效團(tuán)映射方法對(duì)中藥活性小分子進(jìn)行潛在藥物靶標(biāo)預(yù)測(cè)[4]。目前常用的正向分子對(duì)接軟件有Dock、AutoDock Vina、Molegro Virtual Docker、iGemdock以及Systemsdock Web Site服務(wù)器等。Systems dock Web Site是一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和分析的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，它應(yīng)用高精度對(duì)接模擬和分子通路圖，全面表征配體選擇性，并說(shuō)明配體如何作用于復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)。它具有Dock-IN評(píng)分的分子對(duì)接功能，用以評(píng)估蛋白質(zhì)-配體結(jié)合潛力。陳宇綜[5]等人使用INVDOCK查找大黃中大黃素的靶點(diǎn)，事實(shí)證明大黃素的作用潛在靶點(diǎn)是基質(zhì)金屬蛋白酶，這個(gè)預(yù)測(cè)繼而得到抗腫瘤分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)這一驗(yàn)證。陳少軍[6]等利用反向分子對(duì)接成功預(yù)測(cè)出醛糖還原酶可能是丹參醇A的潛在靶蛋白之一。

川陳皮素（nobiletin）是從蕓香科柑桔屬橘子果皮和莖中提取的一種多甲氧基黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[7-9]證實(shí)其具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等多種藥理作用。白潔等[10]基于分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)川陳皮素與P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的 Phe974形成較強(qiáng)的Pi-Pi鍵，并通過(guò)細(xì)胞雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素具有較強(qiáng)的P-gp抑制作用，并從細(xì)胞和整體動(dòng)物水平探討川陳皮素對(duì)P-gp調(diào)控的生物學(xué)效應(yīng)。因此，預(yù)測(cè)和篩選中藥活性成分川陳皮素的潛在分子靶標(biāo)是一項(xiàng)重要且有意義的工作。

本研究利用PharmMapper服務(wù)器對(duì)川陳皮素的潛在靶標(biāo)進(jìn)行虛擬篩選，得到一連串匹配效果不一樣的蛋白靶標(biāo)。對(duì)匹配后得分較高的蛋白靶標(biāo)，采用Systemsdock Web Site服務(wù)器進(jìn)行正向分子對(duì)接驗(yàn)證。從反向和正向分子對(duì)接兩個(gè)方面進(jìn)行潛在靶點(diǎn)探索，以期為川陳皮素的潛在藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)提供理論指導(dǎo)和科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP、反向分子對(duì)接服務(wù)器Pharm Mapper、正向分子對(duì)接服務(wù)器Systemsdock Web Site。

1.1 配體準(zhǔn)備

首先利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)確定川陳皮素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在ChemBioDraw Ultra 14.0程序中繪制配體分子的結(jié)構(gòu)，使用菜單Caculations中力場(chǎng)MMFF94對(duì)其進(jìn)行能量最小化，使得手工畫(huà)上去的那部分的鍵長(zhǎng)和鍵角標(biāo)準(zhǔn)化，從而獲得穩(wěn)定的化合物結(jié)構(gòu)。最后將文件保存為mol格式文件。

1.2 川陳皮素潛在靶標(biāo)預(yù)測(cè)

將川陳皮素的mol格式文件上傳至PharmMapper服務(wù)器，利用反向?qū)臃?wù)器PharmMappe對(duì)川陳皮素進(jìn)行模擬分子-靶蛋白對(duì)接，靶點(diǎn)范圍設(shè)置“Human Protein Targets Only（v2010，2241）”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。PharmMapper服務(wù)器自動(dòng)對(duì)配體小分子與其數(shù)據(jù)庫(kù)中的藥效團(tuán)模型匹配，按照匹配的得分高低排序。

1.3 正向分子對(duì)接驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的蛋白靶標(biāo)，采用systems dock Web Site 軟件，將川陳皮素作為配體與得分靠前且具有疾病治療價(jià)值的3個(gè)靶蛋白分別進(jìn)行正向分子對(duì)接驗(yàn)證。正向分子對(duì)接過(guò)程中由 Docking Score分值表示對(duì)接結(jié)果，打分越高說(shuō)明藥物與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合越好[11]。藥效團(tuán)匹配是基于氫鍵供受體、正負(fù)電荷中心、芳環(huán)中心、疏水基團(tuán)、親水基團(tuán)等藥效特征元素對(duì)分子構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。而分子對(duì)接側(cè)重從靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華力作用預(yù)測(cè)兩者間的結(jié)合模式和親和力等藥效特征元素對(duì)分子構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 川陳皮素結(jié)構(gòu)

川陳皮素的2D及3D結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示。

圖1 川陳皮素的2D結(jié)構(gòu)

圖2 川陳皮素的3D結(jié)構(gòu)

2.2 川陳皮素潛在靶標(biāo)虛擬篩選

為了篩選配體小分子的潛在靶點(diǎn)，采用PharmMapper在線平臺(tái)上把小分子和數(shù)據(jù)庫(kù)中靶標(biāo)蛋白的藥效團(tuán)模型進(jìn)行匹配，根據(jù)Normalized Fit Score打分值對(duì)川陳皮素的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選，得到打分值前15的靶蛋白，如表1所示。

表1 Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白

注：-代表PharmMapper服務(wù)器中篩選的靶蛋白沒(méi)有對(duì)應(yīng)的疾病

2.3 川陳皮素潛在藥效靶標(biāo)的正向分子對(duì)接驗(yàn)證

使用Systemsdock Web Site服務(wù)器，將川陳皮素作為配體與篩選得到的成纖維細(xì)胞激活蛋白（Seprase）、網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4recoptor)、組織蛋白酶L2（CathepsinL2）靶蛋白分別進(jìn)行正向?qū)域?yàn)證。如表2為川陳皮素與三種靶標(biāo)蛋白藥效團(tuán)匹配特征，川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白（Seprase）的藥效團(tuán)模型中沒(méi)有疏水特征，有2個(gè)氫鍵受體1個(gè)氫鍵供體；與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4recoptor）的藥效團(tuán)模型中有沒(méi)有疏水特征，有2個(gè)氫鍵受體1個(gè)氫鍵供體；與組織蛋白酶（CathepsinL2）的藥效團(tuán)模型中有1個(gè)疏水特征，有1氫鍵受體1個(gè)氫鍵供體。

表2 川陳皮素與靶標(biāo)蛋白藥效團(tuán)匹配特征

2.3.1 川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白（Seprase）的分子對(duì)接

圖3為川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白的對(duì)接模型。成纖維細(xì)胞激活蛋白結(jié)合的氨基酸殘基Asn92（B）形成疏水相互作用，同時(shí)Asn92（B）和Asn74（B）與川陳皮素形成氫鍵相互作用，川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白活性位點(diǎn)存在氫鍵作用和疏水作用。圖4為原配體與成纖維細(xì)胞激活蛋白的對(duì)接模型。

圖3 川皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白的分子對(duì)接模型（a）3D圖、（b）平面圖

圖4 原配體與成纖維細(xì)胞激活蛋白的分子對(duì)接模型(c)3D圖、（d)平面圖

2.3.2 川陳皮素與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4recoptor）的分子對(duì)接

圖5為川陳皮素與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體的分子對(duì)接模型圖。網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體結(jié)合蛋白的氨基酸殘基His2163（B）、Gys2025（B）、Phe2069（B）、Asp2162（B）和Gly2023（B）形成疏水相互作用，同時(shí)Phe2069（B）、Gln2019（B）和Trp2189（B）與川陳皮素形成氫鍵相互作用，川皮素與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體活性位點(diǎn)存在氫鍵作用和疏水作用。圖6為原配體與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體的對(duì)接模型。

圖5 川陳皮素與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體的分子對(duì)接模型（a）3D圖、（b）平面圖

圖6 原配體與網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體的分子對(duì)接模型（c）3D圖、（d）平面圖

2.3.3 川陳皮素與組織蛋白酶L2（CathepsinL2）的分子對(duì)接

圖7為川陳皮素與組織蛋白酶的分子對(duì)接模型。組織蛋白酶結(jié)合蛋白的氨基酸殘基Ala154（A）和Ala155（A）形成疏水相互作用，同時(shí)Ala154（A）、Ala155（A）和Asn179（A）與川陳皮素形成氫鍵相互作用，川陳皮素與組織蛋白酶活性位點(diǎn)存在氫鍵作用和疏水作用。原配體與組織蛋白酶受體的對(duì)接模型如圖8所示。

圖7 川陳皮素與組織蛋白酶L2的分子對(duì)接模型（a）3D圖、（b）平面圖

圖8 原配體與組織蛋白酶的分子對(duì)接模型（c）3D圖、（d）平面圖

如圖9所示，中藥活性成分川陳皮素與成纖維細(xì)胞（Seprase）、網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4recoptor）、組織蛋白酶L2（CathepsinL2）3個(gè)藥效靶標(biāo)蛋白對(duì)接分?jǐn)?shù)分別為5.215、5.227、6.090。一般來(lái)說(shuō)，打分的高低決定著分子與靶點(diǎn)的結(jié)合活性，docking score值大于4.25說(shuō)明分子與靶點(diǎn)有一定的結(jié)合活性，大于5.0說(shuō)明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，而大于7.0則說(shuō)明分子與靶點(diǎn)具有很強(qiáng)烈的結(jié)合活性。

圖9 川陳皮素與三個(gè)靶標(biāo)蛋白對(duì)接分值

3 討論

在本研究中基于川陳皮素與PharmMapper中2241個(gè)人類蛋白靶標(biāo)反向?qū)咏Y(jié)果，選取Normalized Fit Score打分值前15的靶蛋白，采用Systemsdock Web Site平臺(tái)對(duì)具有疾病治療價(jià)值的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行正向分子對(duì)接驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)川陳皮素與成纖維細(xì)胞激活蛋白（Seprase）、網(wǎng)織紅細(xì)胞-4受體（Reticulon-4recoptor）、組織蛋白酶L2（CathepsinL2）3個(gè)重要靶蛋白結(jié)合強(qiáng)度較好，Docking Score依次為6.090、5.227、5.215。Seprase是絲氨酸蛋白酶（SIMP）家族的典型代表，人類Seprase最初作為一種糖蛋白肽酶首先在侵襲性惡性黑色素瘤細(xì)胞中被鑒定出來(lái)，有選擇性在浸潤(rùn)前沿的惡性黑色素瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞表面的突出部位表達(dá)[12]。也有研究[13]表明Seprase主要在炎癥、創(chuàng)傷、上皮性癌及其基質(zhì)中被激活的成纖維細(xì)胞中表達(dá)，成熟的體細(xì)胞不表達(dá)?，F(xiàn)已在瘢痕瘤和胰腺癌等多種腫瘤組織發(fā)現(xiàn)Seprase蛋白的高表達(dá)，以Seprase作為上皮性腫瘤免疫檢測(cè)和免疫治療的靶點(diǎn)正在研究中[14-15]。

網(wǎng)織紅細(xì)胞是介于晚幼紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞之間尚未完全成熟的紅細(xì)胞，是紅細(xì)胞成熟過(guò)程的一個(gè)重要階段。鄭扣龍等[16]研究發(fā)現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)數(shù)增高可作為急性心肌梗死住院患者病死率增加的預(yù)測(cè)因子。惡性腫瘤患者在化療開(kāi)始后，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與白細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降，未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化可作為早期評(píng)價(jià)腫瘤患者放、化療后骨髓抑制和恢復(fù)的較敏感指標(biāo)[17-18]。組織蛋白酶作為一種溶酶體蛋白酶可參與多種重要生理活動(dòng)，如蛋白質(zhì)水解、抗原提呈、T細(xì)胞分選、細(xì)胞凋亡、以及胚胎發(fā)育等。有研究[19-22]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶能夠通過(guò)蛋白水解作用降解細(xì)胞外基質(zhì)，催化降解基質(zhì)膜，從而為腫瘤細(xì)胞穿透細(xì)胞外基質(zhì)的移行和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)空間的擴(kuò)展、腫瘤血管的生成等。研究[23-25]表明大量組織蛋白酶 L釋放到胞質(zhì)或組織間隙，并被激活，降解細(xì)胞成分或細(xì)胞間質(zhì)基質(zhì)組分，參與腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

蘇明媛等[26]研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素可提高凋亡蛋白酶caspase-3的活性，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯著抑制Caco-2、HeLa、Hep G2、A375等 5種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，川陳皮素可作為過(guò)氧化酶體增殖物激活型受體激動(dòng)劑，通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)以及降低胞漿中磷脂酶A2的活性來(lái)減少UVB誘導(dǎo)所產(chǎn)生的前列腺素E[27]。宮先衛(wèi)研究[28]發(fā)現(xiàn)川陳皮素可提高細(xì)胞清除活性氧能力以及促進(jìn)NO分泌，對(duì)體外高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。張艷艷等[29]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹都有明顯的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

綜上所述，本研究預(yù)測(cè)出的川陳皮素的主要疾病靶蛋白與川陳皮素抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等藥理作用相吻合，表明通過(guò)反向藥效團(tuán)匹配和分子對(duì)接方法可以預(yù)測(cè)川陳皮素潛在靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性。

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PREDICTION OF POTENTIAL PHARMACODYNAMICS TARGET OF NOBILETIN AND ANALYSIS OF ITS MULTI-DIMENSIONAL PHARMACOLOGICAL ACTION

LI Yue-wen，Zhu Bin，LIU Zhi-qiang，*WANG Bo-long

(School of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China)

To predict and carry molecular docking verification of the potential target of the active product of traditional Chinese medicine nobiletin, to explore its multidimensional pharmacological effects.The reverse molecular docking server PharmMapper was used to dock nobiletin and 2241 human protein targets respectively, then the top 15 target proteins in Normalized Fit Score evaluation were selected to perform positive molecular docking verification by using Systemsdock Web Site platform.Nobiletin combined well with 3 target proteins as Seprase, Reticulon-4 recoptor, and CathepsinL2 with the docking scores of 5.215, 5.227, and 6.090 respectively. The target protein pharmacophore model was consistent with the molecular characteristics of nobiletin. Molecular docking showed that there was interaction between nobiletin and the target protein core amino acids.Nobiletin has good binding strength with three important target proteins as Seprase, Reticulon-4 recoptor, CathepsinL2, and has anti-cancer, anti-oxidation, anti-inflammatory, anti-thrombosis and other pharmacological effects.

nobiletin; reverse molecular docking; pharmacophore model; target protein

1674-8085(2018)05-0073-08

R965.2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.05.015

2018-06-19；

2018-08-31

江西省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”（天然藥物活性成分研發(fā)與應(yīng)用）；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ12596）

李躍文(1993-)，男，河南南陽(yáng)人，碩士生，主要從事臨床藥學(xué)研究(E-mail:1297513234@ qq.com);

朱 斌(1996-)，男，江西吉安人，宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院藥學(xué)專業(yè)2014級(jí)本科生(E-mail:649365048@qq.com);

劉志強(qiáng)(1993-)，男，河南鶴壁人，碩士生，主要從事臨床藥學(xué)研究(E-mail:626814166@ qq.com);

*王博龍(1977-)，男，陜西扶風(fēng)人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥物臨床前研究及臨床有效性與安全性評(píng)價(jià)研究(E-mail:wblong77@126.com).