尤梅桂，吳雅茗，許雅蘋(píng)

?

熊去氧膽酸對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

*尤梅桂1.2，吳雅茗1.2，許雅蘋(píng)1.2

（1．廈門(mén)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建，廈門(mén) 361023；2．機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建，廈門(mén) 361023）

研究熊去氧膽酸（UDCA）對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用。將昆明種小鼠60只隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組（200 mg/kg）、熊去氧膽酸低劑量組（UDCA-L（30 mg/kg）），熊去氧膽酸中劑量組（UDCA-M（60 mg/kg））、熊去氧膽酸高劑量組（UDCA-H（120 mg/kg））。除正常對(duì)照組外，其余各組均灌胃給藥，1次/d，連續(xù)10 d，灌胃容積為0.2 mL/10g。每日灌胃給藥30 min后，除正常對(duì)照組灌胃等容積的蒸餾水外，其余各組小鼠均灌胃35度二鍋頭白酒16 mL/kg，造酒精性肝損傷模型。10 d后，觀察小鼠肝臟、脾臟系數(shù)、檢測(cè)血清ALT、AST，肝組織 SOD、GSH、MDA、NO的水平。HE染色，觀察肝病理變化。UDCA各劑量組均可降低小鼠脾臟系數(shù)和血清ALT、AST 活性，升高肝組織SOD、GSH 活性，并降低肝組織MDA和NO含量（< 0.05或＜0.01）。UDCA對(duì)小鼠酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

熊去氧膽酸；酒精性肝損傷；小鼠

長(zhǎng)期大量飲酒所致的肝臟疾病也稱(chēng)為酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）[1]，大體病理過(guò)程表現(xiàn)為酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝硬化[2]。肝臟損傷程度與飲酒時(shí)間長(zhǎng)短、飲酒量多少及患者營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)，需引起我們注意的是酒精性肝病常常伴隨著很多的并發(fā)癥。雖然國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已經(jīng)對(duì)酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制、藥物治療、藥物作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，也試圖開(kāi)發(fā)更多新型的、有效的保肝藥，但臨床上對(duì)其尚缺乏較為有效的治療方法和特效藥。因此，尋找安全有效的治療藥物迫在眉睫。本研究就熊去氧膽酸對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，旨在為臨床應(yīng)用更為安全有效的治療藥物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠60只，20~24月齡，體重17~22g，由福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為（SCXK（閩）2012-0001），在室溫環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前預(yù)養(yǎng)3d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

熊去氧膽酸片（優(yōu)思弗），規(guī)格：每片中含熊去氧膽酸50 mg，購(gòu)自上海中西三維藥業(yè)有限公司。聯(lián)苯雙酯滴丸，規(guī)格：1.5 mg/丸。臨用前分別用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配置成所需濃度；ALT、AST、SOD、GSH、MDA、NO檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Multiskan全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)熱電），5804R臺(tái)式高速常壓離心機(jī)（德國(guó)eppendoff公司），Exceed-bd-24系列實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都唐氏唐寧科技發(fā)展有限公司），Satorius分析天平（北京多利絲天平有限公司），WH-861旋渦混合器（上海環(huán)球物化儀器廠）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

60只昆明種小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分成6組，每組10只，即正常對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯組(200 mg/kg)、UDCA-L(30 mg/kg)、UDCA-M (60 mg/kg)、UDCA-H(120 mg/kg)。除正常對(duì)照組和模型組給予0.5%羧甲基纖維素鈉外，其余4組均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)10 d，灌胃容積為0.2 mL/10g。

1.5 動(dòng)物模型的建立

每日灌胃給藥30 min后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均灌胃35度二鍋頭白酒16 mL/kg，正常對(duì)照組灌胃等容積的蒸餾水。第10 d給酒后禁食不禁水，24 h后稱(chēng)重，采集血和肝臟、脾臟標(biāo)本，作相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 檢查項(xiàng)目及方法

①小鼠肝臟、脾臟系數(shù)的檢測(cè)：小鼠頸椎脫臼處死后，取肝、脾臟，用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱(chēng)重，計(jì)算肝臟、脾臟系數(shù)。臟器系數(shù)（%）= 臟器重量（g）/體重（g）×100%；②生化指標(biāo)的檢測(cè)：小鼠摘眼球取血，3500 r/min離心10 min，分離血清，檢測(cè)血清ALT、AST含量。取肝右葉相同部位的一小塊肝組織，以4℃生理鹽水制成10% 肝勻漿，2000 r/min離心10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織SOD、GSH的活性及MDA、NO的含量。肝臟病理組織學(xué)檢查：大鼠肝臟用10%甲醛固定，取材、脫水、浸蠟、包埋，再切成4 μm厚切片，HE染色，光鏡下觀察并拍照（×200）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UDCA對(duì)小鼠酒精性肝損傷肝、脾臟系數(shù)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟、脾臟系數(shù)均明顯升高，差異具有顯著性（< 0.05）。與模型組比較，各給藥組均可以降低脾臟系數(shù)（< 0.05）；與模型組相比，除UDCA-H組可以降低肝臟系數(shù)（< 0.05）外，其他各組均降低了小鼠肝臟系數(shù)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 UDCA對(duì)小鼠肝臟、脾臟系數(shù)的影響（ ± s，n = 10）

注：與正常對(duì)照組相比，#< 0.05，與模型組比，*< 0.05

2.2 UDCA對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST含量顯著升高（< 0.01）。與模型組相比，除UDCA低劑量組外，各給藥組均能降低小鼠血清ALT、AST的含量（< 0.01），表明UDCA對(duì)小鼠酒精性脂肪肝的具有保護(hù)作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 UDCA對(duì)小鼠血清ALT、AST的影響（ ± s，n = 10）

注：與正常對(duì)照組相比，#< 0.05，##< 0.01，與模型組比*< 0.05，**< 0.01

2.3 UDCA對(duì)肝組織SOD、GSH活性和MDA、NO含量的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織SOD、GSH活性和MDA、NO含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（< 0.01）。與模型組比較，UDCA各給藥組均升高了小鼠肝組織SOD、GSH活性，并顯著降低肝組織MDA和NO的含量（< 0.05或< 0.01）。表明UDCA可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激的作用機(jī)制發(fā)揮保肝作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 UDCA對(duì)小鼠肝組織SOD、GSH活性和MDA、NO含量的影響（±s，n = 10）

注：與正常對(duì)照組相比，#< 0.05，##< 0.01，與模型組比*< 0.05，**< 0.01

2.4 UDCA對(duì)肝組織形態(tài)學(xué)變化的影響

正常對(duì)照組小鼠肝小葉、匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝組織未見(jiàn)明顯變性、壞死，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變；模型組肝小葉區(qū)細(xì)胞索狀排列絮亂，出現(xiàn)肝脂肪變性，胞漿疏松，并且有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變；陽(yáng)性組、UDCA高、中劑量組：肝小葉匯管區(qū)、中央靜脈區(qū)細(xì)胞索狀排列清晰，僅小部分肝細(xì)胞脂肪變性。UDCA低劑量組：肝細(xì)胞出現(xiàn)輕、中度脂肪樣變性及胞漿疏松，部分肝細(xì)胞溶解壞死呈空網(wǎng)狀病灶。結(jié)果見(jiàn)圖1。

A.模型組 B.正常對(duì)照組 C.聯(lián)苯雙酯組 D. UDCA-H組 E. UDCA-M組 F. UDCA-L組

3 討論

熊去氧膽酸具有改變膽汁酸池組成、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝細(xì)胞膜、增加膽汁中碳酸氫鹽等作用，還可抑制肝細(xì)胞凋亡而顯著改善肝功能和肝組織學(xué)病變，進(jìn)而改善患者酒精性肝炎[3]。因此，熊去氧膽酸在臨床上也可作為重要肝病治療輔助用藥。

由酒精性肝損傷引起的酒精性肝病是僅次于病毒性肝炎的第二大肝病[4]。研究表明，人體攝入大量酒精之后，乙醇會(huì)脫氫氧化變成乙醛，乙酸進(jìn)一步氧化變成乙酸，如果人體缺少乙醛脫氫酶，不能將乙醛代謝，會(huì)使三羧酸循環(huán)出現(xiàn)障礙，進(jìn)而影響脂肪代謝，使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積下來(lái)[5-6]，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹壞死，而目前尚缺乏特效藥物治療。血清中AST、ALT含量作為早期肝損傷的重要指標(biāo)，可直接反映肝細(xì)胞損傷程度[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清AST、ALT含量顯著性升高，而熊去氧膽酸能顯著降低ALT、AST水平，表明熊去氧膽酸對(duì)酒精引起的小鼠肝損傷起到一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究還顯示，UDCA能升高肝組織SOD、GSH 活性，并降低肝組織MDA和NO含量，因此我們推測(cè)UDCA的保肝作用機(jī)制可能是通過(guò)抗氧化應(yīng)激對(duì)抗酒精引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。隨著UDCA劑量的加大療效不斷增強(qiáng)，提示熊去氧膽酸對(duì)酒精性脂肪肝的保護(hù)作用呈劑量依賴(lài)性。隨著臨床醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的深入，有關(guān)UDCA保肝作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究探索。

[1] 毛中伏,談碩彥,閆昌譽(yù),等. 解酒中藥復(fù)方“肝易復(fù)”對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2016, 4(2): 47-48.

[2] 尤梅桂,陳同,倪遠(yuǎn)寧,等. 復(fù)方熊去氧膽酸口服液對(duì)大鼠淤膽型肝炎的影響[J]. 中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2014, 20(11): 14-15.

[3] 王愛(ài)東. 熊去氧膽酸治療酒精性肝炎伴膽汁淤積患者的臨床觀察[J]. 肝臟,2014, 19(5): 387-388.

[4] 趙文璽,金梅花,李天,等. 熊去氧膽酸聯(lián)合復(fù)方甘草酸苷片治療乙肝肝硬化伴膽汁淤積臨床效果分析[J]. 深圳中西醫(yī)雜志, 2015, 18(26): 87-88.

[5] 楊曉筠. 熊去氧膽酸治療酒精性肝病伴膽汁淤積患者療效分析[J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2013, 12(10): 12-13．

[6] 錢(qián)善軍,劉瑋,闞晶,等. 虎杖對(duì)大鼠酒精性脂肪肝的干預(yù)作用及其機(jī)制研究[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版, 2017, 38(3): 96-99.

[7] 陳奇,陳松海,陳小凱. 熊去氧膽酸膠囊聯(lián)合門(mén)冬氨酸鳥(niǎo)氨酸注射液治療抗腫瘤藥所致藥物性肝損傷的臨床研究[J]. 中國(guó)臨床藥學(xué)雜志, 2018,7(14): 412-413.

[8] 徐慶玲,姚履楓. 熊去氧膽酸聯(lián)合腺苷蛋氨酸治療慢性乙型肝炎合并妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥療效分析[J]. 海峽藥學(xué), 2016, 28(3): 113-115.

[9] 孫鳳霞,隋京利,李攀,等. 膽汁淤積性肝病診斷相關(guān)生化指標(biāo)的探討[J]. 臨床肝膽病雜志,2016,32(8):1488- 1490.

PROTECTIVE EFFECTS OF URSODEOXYCHOLIC ACID AGAINST ALCOHOL-INDUCED HEPATIC INJURY IN MICE

*YOU Mei-gui1.2, WU Ya-ming1.2, XU Ya-ping1.2

(1. Department of Basic Medicine, Xiamen Medical College, Xiamen, Fujian 361023, China; 2. Key Laboratory of Functional and Clinical Translational Medicine, Fujian Province University, Xiamen, Fujian 361023, China)

To study the protective effect of ursodeoxycholic acid (UDCA) on alcoholic liver injury in mice.Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, bifendate group (200 mg/kg), UDCA-L (30 mg/kg), UDCA-M (60 mg/kg), UDCA-H (120 mg/kg). All groups beside the control were intragastrically administered once a day for 10 days and the volume of gastric perfusion was 0.2 ml/10 g. A model of alcoholic liver injury was established by intragastric administration of 35 degree Erguotou white wine 16 ml/kg after 30mins. After 10 days, the liver, spleen coefficient were observed, serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), liver tissue superoxide dismutase (SOD) activity, glutathione peroxidase (GSH) activity, and malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO) levels were detected. Histopathological changes in liver tissue were also examined by HE staining.UDCA could reduce the spleen coefficient, serum ALT, AST activity, increase the activity of SOD and GSH in liver and decrease the contents of MDA and NO in liver tissue (< 0.05 or< 0.01).UDCA extract has a protective effect on alcoholic liver injury in mice.

ursodeoxycholic acid; alcoholic liver injury; mice

1674-8085(2018)05-0103-04

R965

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2018.05.020

2018-05-07；

2018-08-06

福建省衛(wèi)計(jì)委青年科研計(jì)劃項(xiàng)目（2016-02-80）；福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JT180653）

*尤梅桂(1988-05)，女，福建泉州人，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事藥理實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作(E-mail:1131785628@qq.com);

吳雅茗(1980-07)，女，福建晉江人，講師，碩士，主要從事藥理學(xué)和藥學(xué)服務(wù)研究(E-mail: wy0511@163.com);

許雅蘋(píng)(1987-05)，女，福建廈門(mén)人，講師，博士，主要從事腫瘤微環(huán)境研究(E-mail: yapingxu13@163.com).