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(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002)

小麥苗期病蟲害是影響小麥產(chǎn)量的主要因素。隨著種衣劑的推廣和應(yīng)用，通過種衣劑處理小麥種子來預(yù)防小麥苗期病蟲害逐漸成為一種重要的農(nóng)業(yè)措施。研究表明，種衣劑可以提高小麥抗氧化酶活性、促進(jìn)小麥植株生長、提高小麥對逆境和病蟲害的抗性[1-2]，從而達(dá)到小麥的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。但是，種衣劑對植物產(chǎn)生的負(fù)面影響也有報道，例如烯唑醇種衣劑包衣對小麥的出苗時間和出苗率具有抑制作用[3]；戊唑醇懸浮種衣劑對小麥種子萌發(fā)的影響主要表現(xiàn)在推遲出苗時間和增加畸形植株數(shù)量[4]；三唑類殺菌劑易引起小麥和玉米不同程度的藥害，影響作物幼苗出土、抑制幼苗生長[5]等。

以吡蟲啉(Imidacloprid)為原藥的種衣劑可以由植物根系吸收，持效期長，能有效防治水稻、小麥、甜菜等作物苗期害蟲，尤其對刺吸式口器害蟲有特效[6]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉種衣劑會推遲小麥出苗時間，而這種作用產(chǎn)生的原因可能是吡蟲啉種衣劑影響種子吸水性和萌發(fā)相關(guān)酶活性從而推遲小麥種子萌發(fā)[7]。植物體內(nèi)的氮化物包括蛋白質(zhì)、氨基酸等，主要用于組成原生質(zhì)，促進(jìn)植物生長。在生長初期，植物吸收氮的能力強(qiáng)，以氮素代謝為主，此時正是器官建成時期，需要大量的氮素供應(yīng)，以防止后期早衰。因此在植物生長初期，氮素代謝對植物生長發(fā)育起著重要的作用。關(guān)于吡蟲啉種衣劑對植物氮代謝的影響以及這些影響產(chǎn)生的機(jī)理目前仍不清楚。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過分析吡蟲啉種衣劑對小麥萌發(fā)和幼苗生長階段氮代謝途徑關(guān)鍵酶活性以及酶編碼基因表達(dá)和代謝產(chǎn)物的影響，研究種衣劑對小麥初生代謝的影響，為種衣劑的安全使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

矮抗58小麥，購自河南秋實種業(yè)科技股份有限公司；600 g/L 吡蟲啉懸浮種衣劑，江蘇龍燈化學(xué)有限公司產(chǎn)品，購自鄭州市農(nóng)藥市場。

1.2 研究方法

1.2.1 拌種處理

吡蟲啉懸浮種衣劑分別設(shè)置6.67，13.34 g/kg制劑種子2個濃度梯度(下文中分別以吡蟲啉1.0×和吡蟲啉2.0×表示)，分別取6.67 g和13.34 g吡蟲啉種衣劑，加適量清水稀釋后對1 kg矮抗58小麥種子進(jìn)行拌種，清水拌種作為空白對照[7]。為了防止種衣劑脫落，種衣劑拌種后的種子在陰涼處晾干后再進(jìn)行萌發(fā)實驗[8]。

1.2.2 萌發(fā)試驗

選取不同濃度吡蟲啉包衣小麥種子各25粒置于墊有3層濾紙的加水培養(yǎng)皿中，每處理各3個重復(fù)，每個重復(fù)含3個培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中[(20±1)℃，每日光照16 h，黑暗8 h]培養(yǎng)發(fā)芽，每天在同一時間補(bǔ)充相同量的水分，分別在種子萌發(fā)第3、6、9、12、15天時隨機(jī)取樣，樣品保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)量測定

根據(jù)NCBI已公布的基因序列，設(shè)計用于PCR反應(yīng)的小麥氮代謝相關(guān)酶基因引物序列(表1)。采用Trizol法提取樣品RNA，紫外分光光度計測量OD值后，用兩步法反轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA，梯度PCR測定引物的最適退火溫度，再以Actin為目的基因，SYBR?green I 為熒光染料進(jìn)行實時熒光定量PCR，總體系12μL(SYBR?green I 6μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、稀釋5倍的模板cDNA 1μL和雙蒸水4μL)，2-ΔΔC(t)法計算結(jié)果。

表1 氮代謝相關(guān)酶基因的引物

基因酶參考序列引物序列NR硝酸還原酶X57844.1F:gctgatgcaccacggcttcaR:gggaaaccgttggcaagctcNiR亞硝酸還原酶FJ527909F:attattcgccgtcgtcgtcR:atatgccgccctccgtgaagGS谷氨酰胺合成酶JF894116.1F:gcccttcaccgacaagatcaR:atggcctgtgggtatagaaGOGAT谷氨酸合成酶KF521800F:cgacatcttagcagaacgtggagR:ccatcaccggagtcgttgGDH谷氨酸脫氫酶HQ821868F:gagtgcacaattccgaaagR:gaatattggccacggctgACTINAB181991.1F:tggcatcacacgttctacaacR:gcctggattgcgacata

1.2.4 氮代謝相關(guān)酶活性測定

1) 硝酸還原酶(Nitrate reductase，NR)活性測定：參考高俊鳳[9]的方法。樣品加入提取緩沖液及少量石英砂冰浴中研磨勻漿，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，所得上清液即為粗酶提取液。取粗酶液0.2 mL，加入0.3 mL 2 mg/mL NADH溶液和0.5 mL 0.1 mol/L KNO3溶液混勻， 25 ℃保溫30 min，以1 mL 30%三氯乙酸作為對照。保溫結(jié)束后加入1 mL 30%三氯乙酸搖勻以終止反應(yīng)，加入2 mL 0.2% a-萘胺溶液，2 mL 1%磺胺溶液，搖勻靜置顯色15 min，測定反應(yīng)液在520 nm的吸光度。根據(jù)回歸方程計算反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量[10]。

2) 亞硝酸還原酶(Nitrite reductase，NiR)活性測定：參考Scheible W R等[11]的方法。反應(yīng)液(1.35 mL)包括：0.05 mL 10 mmol的亞硝酸鈉溶液、1 mL pH=7.5的100 mmol磷酸鈉緩沖液、0.05 mL甲基紫精溶液、蒸餾水0.05 mL，最后加酶提取物0.15 mL。反應(yīng)液中加入0.05 mL連二亞硫酸鈉鹽(50 mg/mL)后在25 ℃下反應(yīng)30 min。取0.2 mL反應(yīng)液加蒸餾水稀釋至6.7 mL，加入1%(w/v)鹽酸萘乙二胺1.5 mL和1.8 mL 1%磺胺。15 min后，測定反應(yīng)液在540 nm處吸光率。

3) 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)活性測定：提取緩沖液：0.05 mol/L Tris-HCl，pH=8.0，含2 mmol/L DTT、2 mmol/L MgSO4、0.4 mol/L蔗糖；反應(yīng)混合液A：0.1 mol/L pH=7.4 Tris-HCl緩沖液，含20 mmol/L谷氨酸鈉鹽，80 mmol/L Mg2+，20 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA；反應(yīng)混合液B(含鹽酸羥胺，pH=7.4)：反應(yīng)混合液A再加入80 mmol/L鹽酸羥胺；顯色劑：0.2 mol/L TCA，0.37 mol/L FeCl3和0.6 mol/L HCl的混合液；40 mmol/L ATP溶液(臨用前配制)。樣品冰浴中加入提取緩沖液研磨勻漿，4 ℃，15 000 g離心20 min，所得上清液為粗酶液。取0.7 mL粗酶液加入1.6 mL反應(yīng)混合液B和0.7 mL ATP溶液混勻，并置于37 ℃下保溫。30 min后加入1 mL顯色劑搖勻，5 000 g下離心10 min，取上清液測定其在540 nm處的吸光值。以加入1.6 mL反應(yīng)混合液A的溶液作為對照[12]。

4) 谷氨酸合成酶(Glutamate synthase，GOGAT)活性測定：提取液配制以及粗酶液提取方法采用上述GS酶活性測定中的方法進(jìn)行。反應(yīng)混合液含0.4 mL 20 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.5 mL 20 mmol/L a-酮戊二酸、0.2 mL 3 mmol/L NADH和0.3 mL粗酶液，用25 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=7.6)補(bǔ)足1.5 mL。于340 nm處每隔30 s測定反應(yīng)液消光值，取光密度穩(wěn)定減小的一段來衡量酶活性[13]。

5) 谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)活性測定：提取液為0.2 mmol/L Tris-HCl(pH=8.2)；反應(yīng)液A：1.6μmol/L NAD+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)；反應(yīng)液B：1.6μmol/L NAD+60μmol/L L-谷氨酸+360μmol/L Tris-HCl(pH=9.0)。植物材料冰浴中加入提取液研磨勻漿，取1 mL酶提取液加入2 mL反應(yīng)液B，以反應(yīng)液A為對照，反應(yīng)溶液在340 nm處比色，每隔30 s記錄一次消光值，直至讀數(shù)穩(wěn)定[14]。

1.2.5 氮代謝物質(zhì)含量測定

可溶性蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮藍(lán)法[15]；游離氨基酸總量測定：采用茚三酮顯色法[16]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析和處理方法

實驗數(shù)據(jù)通過Excel 2010軟件進(jìn)行處理，用SPSS 19.0軟件方差分析和相關(guān)性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種衣劑對氮代謝酶編碼基因表達(dá)的影響

選擇植物氮代謝途徑中的關(guān)鍵酶：硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)為研究對象，首先利用熒光定量PCR法分析種衣劑處理后氮代謝途徑關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)變化，研究種衣劑對氮代謝途徑酶編碼基因表達(dá)的影響。結(jié)果(圖1)顯示：高濃度的吡蟲啉處理后小麥植株中氮代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量均顯著下降；而低濃度的吡蟲啉處理后NR基因表達(dá)量除了小麥萌發(fā)第9天明顯提高，其余時期降低。結(jié)果說明吡蟲啉種衣劑會降低氮代謝途徑關(guān)鍵酶的基因的表達(dá)量，而且這種抑制作用和種衣劑的使用濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

注：“*”和“**”分別表示差異顯著(p<0.05)和極顯著(p<0.01)。下同。圖1 吡蟲啉對小麥氮代謝基因表達(dá)量的影響

圖2 吡蟲啉對小麥氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

圖3 吡蟲啉包衣對小麥氮代謝產(chǎn)物含量的影響

2.2 種衣劑對氮代謝酶活性的影響

在確定吡蟲啉種衣劑影響植株氮代謝基因表達(dá)的基礎(chǔ)上，采用生理生化方法測定了硝酸還原酶(NR)、亞硝酸還原酶(NiR)、谷氨酸合成酶(GOGAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性。結(jié)果(圖2)顯示：低濃度吡蟲啉種衣劑處理后NR和GS酶活性增加，而NiR、GOGAT和GDH酶活性降低，高劑量吡蟲啉種衣劑處理后NR、NiR和GDH酶活性降低；而GS和GOGAT酶活性反而增加。從結(jié)果看出，不同濃度種衣劑對氮代謝酶活性的影響不同，不同酶活性對種衣劑的相應(yīng)也不相同。

2.3 種衣劑對氮代謝產(chǎn)物的影響

為了揭示種衣劑對氮代謝水平的影響，分析了種衣劑對植物氮代謝產(chǎn)物：游離氨基酸含量和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。從圖3可看出，吡蟲啉種衣劑處理后小麥植株中可溶性蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量顯著增加，而且隨著與種衣劑的使用濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

3 結(jié)論與討論

氮代謝是植物生命活動中最基本的代謝體系之一，主要作用包括無機(jī)氮的同化、還原以及含氮有機(jī)化合物的合成、轉(zhuǎn)化等。植物生長初期，正是器官建成時期，吸收氮的能力強(qiáng)，以氮素代謝為主。因此研究種衣劑對植物幼苗生長時期氮代謝的影響可以揭示種衣劑對植物生長發(fā)育影響的生理基礎(chǔ)，具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉種衣劑可推遲小麥種子萌發(fā)，影響小麥幼苗生長[7]。因此，本研究擬研究吡蟲啉種衣劑對小麥氮代謝的影響，揭示吡蟲啉種衣劑對小麥影響產(chǎn)生的生理機(jī)制。

植物體內(nèi)NR和NiR分別催化NO3-還原為NO2-和NO2-還原為NH4+，最終NH4+參與到蛋白質(zhì)的合成。NR和NiR酶是氮代謝的關(guān)鍵酶，其活性的調(diào)控在氮同化控制中起著重要作用，并顯著影響植物生長發(fā)育[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中亞NiR基因表達(dá)和酶活性均顯著下降。谷氨酰胺合成酶(GS)是氮代謝過程中的關(guān)鍵酶，能催化NH4+和谷氨酸合成谷氨酰胺，是高等植物氮素同化的主要途徑[18]，過量的NH4+對植物機(jī)體有毒害作用，而GS活性增強(qiáng)可以促進(jìn)銨態(tài)氮與谷氨酸合成谷氨酰胺，進(jìn)一步合成谷氨酸，使NH4+同化加強(qiáng)，是植物的一種自我保護(hù)機(jī)制[19-20]。結(jié)果顯示，處理后GS基因表達(dá)下降，但是催化活性卻顯著增加，可能是在種衣劑處理下，需要加速氮代謝，從而加強(qiáng)植物的自我保護(hù)。同時，GDH活性呈增加趨勢，可以促進(jìn)NH4與a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成谷氨酸，有助于氮代謝的進(jìn)行[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，種衣劑處理后，植株中GDH基因表達(dá)量和酶活性均顯著降低。

游離氨基酸在植物細(xì)胞中以游離態(tài)存在，可被合成氨基酸和蛋白質(zhì)，是植物氮運(yùn)輸?shù)闹饕问絒22]。用游離氨基酸含量可部分反映氮轉(zhuǎn)化的生理變化，游離氨基酸含量減少，可促使氮的轉(zhuǎn)化向蛋白質(zhì)合成的方向發(fā)展[19]?？扇苄缘鞍资切←湹锢鄯e的主要形式和最終產(chǎn)物，因此在同化物代謝的過程中起著重要作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著增加，而且呈現(xiàn)出濃度效應(yīng)。說明吡蟲啉種衣劑處理后，小麥植株中氮代謝加快，氮素消耗加速，如果不及時補(bǔ)充氮源，則會影響小麥的生長和發(fā)育。