朱金燕，彭燦，胡容峰#，湯繼輝，金涌

（1.安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽 安慶 246052；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230031；3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032）

阿托伐他汀鈣（ATV）是臨床上治療高膽固醇血癥、混合型高脂血癥，防治冠心病和腦卒中的常用選擇競(jìng)爭(zhēng)性3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑[1]。該藥可抑制體內(nèi)膽固醇的合成，降低血清低密度脂蛋白（LDL）含量，從而達(dá)到調(diào)整體內(nèi)血脂水平的目的[2]。丹紅注射液是由丹參和紅花組方制成的中藥注射劑，其主要功能為活血化瘀、通脈舒絡(luò)，常用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死等[3]。臨床上常采用丹紅注射液聯(lián)合ATV治療冠心病、心絞痛等，研究顯示聯(lián)合用藥后臨床療效顯著增強(qiáng)[4]，但兩者聯(lián)用后的藥動(dòng)學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究表明，多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）、微粒體混合功能氧化酶系中的細(xì)胞色素P450（CYP450）等均可影響ATV的血藥濃度及降脂效果[5]。據(jù)報(bào)道，丹參的主要成分能夠抑制P-gp的表達(dá)[6-8]及大鼠肝微粒體酶的活性[9-10]。因此，丹紅注射液聯(lián)合給藥后，可能通過(guò)影響P-gp或CYP450而對(duì)ATV的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響后者藥效的發(fā)揮?；诖耍P者通過(guò)研究丹紅注射液?jiǎn)未谓o藥對(duì)ATV在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為的影響，為探究臨床聯(lián)合使用丹紅注射液與ATV的安全性及合理性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters AcquityTM超高效液相色譜（UPLC）系統(tǒng)，包括Waters串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）檢測(cè)器、Masslynx 4.1工作站（美國(guó)Waters公司）；LC-4016型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS型高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；XW-80A型微型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；BCD-225CHC型冰箱（合肥美菱股份有限公司）；Milli-Q GradientA10型超純水系統(tǒng)[密理博（上海）貿(mào)易有限公司]。

1.2 藥品與試劑

丹紅注射液（陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)：13101001，規(guī)格：10 mL/支）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：J01570，規(guī)格：10 mg）；阿托伐他汀鈣對(duì)照品（批號(hào)：100590-201303，純度：＞95.3%）、鹽酸噻氯匹定對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：20120812，純度：＞99%）均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠24只，雌雄各半，體質(zhì)量為（200±20）g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為AcquityTMBEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為5 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）、流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫（0→1.0 min，20%B；1.0→1.3 min，20%B→80%B；1.3→2.0 min，80%B→60%B；2.0→4.0 min，60%B→80%B；4.0→7.0 min，80%B→20%B；7.0→8.0 min，20%B）；柱溫為30 ℃；流速為0.2 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI），采用正離子檢測(cè)方式；毛細(xì)管電壓為3.60 kV；離子源溫度為150℃，去溶劑化溫度為500℃；噴霧氣為氮?dú)?，碰撞氣為氬氣；ATV和鹽酸噻氯匹定（內(nèi)標(biāo)）的錐孔電壓分別為44、30 V，碰撞能分別為22、26 eV；采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）模式，質(zhì)荷比（m/z）分別為 559.20→440.20（ATV）、264.20→154.05（內(nèi)標(biāo)）。

2.2 溶液的制備

精密稱(chēng)取ATV對(duì)照品2.00 mg于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得40 μg/mL的ATV對(duì)照品貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的ATV系列對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取鹽酸噻氯匹定適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液；精密量取該貯備液適量，用甲醇稀釋制成20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。上述溶液均于4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品預(yù)處理

取大鼠血漿100 μL置于肝素化處理過(guò)的離心管中，加入20 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋混合2 min；然后加入甲醇200 μL沉淀蛋白，渦旋混合3 min后，12 000 r/min離心10 min；吸取上清液，以0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，取5 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性考察 取大鼠空白血漿、大鼠空白血漿+丹紅注射液（空白血漿與丹紅注射液體積比為10∶1）、大鼠空白血漿+ATV對(duì)照品（ATV在血漿中的終質(zhì)量濃度為62.50 ng/mL）、大鼠灌胃ATV（10 mg/kg）后2 h時(shí)血漿及大鼠灌胃ATV（10 mg/kg）+尾靜脈注射丹紅注射液（2 mL/kg）后2 h時(shí)血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理（其中大鼠空白血漿、空白血漿+丹紅注射液不加內(nèi)標(biāo)），按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)和丹紅注射液中的各成分均不干擾ATV和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，本方法專(zhuān)屬性良好；ATV保留時(shí)間約為5.8 min，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間約為3.5 min，兩者峰形均良好。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量下限考察 取大鼠空白血漿，分別加入不同質(zhì)量濃度的ATV對(duì)照品溶液適量，配制成 ATV 質(zhì)量濃度分別為 62.50、25.00、12.50、6.25、2.50、1.25、0.25 ng/mL的血漿樣本，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，并按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以ATV的血藥濃度（c）為橫坐標(biāo)、ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y＝0.101 9c+0.149 6（R2＝0.999 4）。結(jié)果表明，ATV的血藥濃度線性范圍為0.25～62.50 ng/mL，定量下限為0.25 ng/mL（RSD＝5.8%，n＝6）。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取大鼠空白血漿，分別加入不同質(zhì)量濃度的ATV對(duì)照品溶液適量，配制成ATV低、中、高質(zhì)量濃度（1.25、6.25、25.00 ng/mL）的血漿樣本，每個(gè)濃度平行配制6份，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，并按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，單日內(nèi)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日內(nèi)及日間精密度。結(jié)果顯示，ATV低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣本的日內(nèi)RSD分別為8.34%、4.52%、9.31%（n＝18），日間RSD分別為6.25%、8.13%、10.79%（n＝18），表明本方法精密度良好，符合生物樣品分析要求。

圖1 各血漿樣本總離子流色譜圖Fig 1 TIC chromatogram of plasma samples

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制ATV低、中、高質(zhì)量濃度（1.25、6.25、25.00 ng/mL）的血漿樣本，每個(gè)濃度平行配制6份，同法預(yù)處理后進(jìn)樣，測(cè)得ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y1）；另取空白血漿，同法預(yù)處理后加入適量ATV對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，測(cè)得ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y空白）。按公式Y(jié)1/Y空白×100%計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，ATV低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣本的平均提取回收率分別為88.30%、91.46%、87.64%，RSD均小于11%（n＝6）。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制ATV低、中、高質(zhì)量濃度（1.25、6.25、25.00 ng/mL）的血漿樣本，每個(gè)濃度平行配制6份，分別在室溫放置12 h、－80℃-室溫反復(fù)凍融3次、－80℃放置14 d后，按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，并按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，ATV低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣本的血藥濃度RSD分別為5.45%、6.78%、11.53%，RSD均小于15%（n＝6），表明血漿樣本中的ATV在上述條件下均較穩(wěn)定。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制ATV低、中、高質(zhì)量濃度（1.25、6.25、25.00 ng/mL）的血漿樣本，每個(gè)濃度平行配制6份，同法預(yù)處理后進(jìn)樣，測(cè)得ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y2）；另以水代替血漿配制樣本，同法預(yù)處理后進(jìn)樣，測(cè)得ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y水）。按公式Y(jié)2/Y水×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME）。結(jié)果顯示，ATV低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣本的平均ME分別為89.42%、86.54%、94.24%，RSD均小于10%（n＝6）。

2.5 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

取24只大鼠，隨機(jī)分為ATV單用組和丹紅注射液低、中、高劑量聯(lián)用組，每組6只。結(jié)合文獻(xiàn)[11-13]并按人與大鼠體表面積比進(jìn)行換算，確定各組ATV的給藥劑量均為10 mg/kg，聯(lián)用丹紅注射液低、中、高劑量分別為1、2、4 mL/kg。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食不禁水12 h，次日清晨除ATV單用組大鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水外，其余大鼠尾靜脈注射相應(yīng)劑量的丹紅注射液；5 min后，各組大鼠均灌胃ATV（將ATV片劑以羥甲基纖維素鈉溶液溶解后給藥）。灌胃給藥前（0 h），給藥后5、10、15、30、45 min和1、2、4、6、8、12、24 h時(shí)在大鼠眼底靜脈叢取血0.4 mL，置于肝素化處理的試管中，3 500 r/min離心10 min分離血漿。血漿樣本按“2.3”項(xiàng)下方法預(yù)處理，并按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將測(cè)得的ATV與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度。各組大鼠體內(nèi)ATV的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠體內(nèi)ATV的平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n＝6）Fig 2 Average plasma concentration-time curves of ATV in rats in each group（n＝6）

采用3p97軟件計(jì)算各組大鼠體內(nèi)ATV的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，詳見(jiàn)表1。ATV在各組大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征均符合非房室模型。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行組間單因素方差分析，結(jié)果表明丹紅注射液低、中、高劑量聯(lián)用組的cmax、AUC0-24、AUC0-∞均高于ATV單用組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠體內(nèi)ATV的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（x±s，n＝6）Tab 1 Pharmacokinetic parameters of ATV in rats（x±s，n＝6）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠血漿中ATV藥物濃度的UPLC-MS/MS測(cè)定法，該方法簡(jiǎn)便，精密度、回收率高，穩(wěn)定性較好，且不受內(nèi)源性物質(zhì)干擾，專(zhuān)屬性好。篩選色譜條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入甲酸銨和甲酸后，可有效改善ATV的峰形及響應(yīng)值。該檢測(cè)方法定量下限低至0.25 ng/mL，可準(zhǔn)確測(cè)定大鼠血漿中ATV的含量，靈敏度高。

藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ATV單用組比較，除丹紅注射液低劑量聯(lián)用組的cmax之外，丹紅注射液各劑量聯(lián)用組的ATV藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax、AUC0-24h、AUC0-∞均大幅度提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但tmax、t1/2、MRT0-24h等參數(shù)卻無(wú)顯著差異。筆者分析其原因可能為：（1）ATV是P-gp的底物[14]，當(dāng)ATV與丹紅注射液聯(lián)合用藥時(shí)，丹紅注射液中的主要成分如羥基丹參酮ⅡA[6]、紅花黃色素A[7]、隱丹參酮[8]等可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp而使ATV在體內(nèi)的吸收量增加，從而使cmax等參數(shù)明顯增大；（2）CYP3A4是ATV代謝的關(guān)鍵酶[15]，而有研究證實(shí)丹紅注射液不會(huì)影響CYP3A4的活性[16]，故不會(huì)影響ATV在體內(nèi)的代謝速度，因此t1/2等參數(shù)無(wú)顯著差異。

另外，丹紅注射液臨床靜脈注射給藥劑量為4 mL，根據(jù)人體表面積換算后的大鼠給藥劑量為0.8 mL/kg。參考文獻(xiàn)[11-13]，本研究最終確定丹紅注射液的低、中、高劑量分別為1、2、4 mL/kg。ATV的臨床起始給藥劑量為10 mg，根據(jù)人體表面積換算后的大鼠起始給藥劑量應(yīng)該為1 mg/kg。然而，Shu N等[17]采用10 mg/kg作為ATV的大鼠給藥劑量；Galani V等[18]研究格列美脲與ATV的相互作用時(shí)選擇ATV的大鼠給藥劑量為60 mg/kg。綜合以上文獻(xiàn)并考慮到本研究所建立檢測(cè)方法的靈敏度，最終選擇10 mg/kg ATV作為大鼠給藥劑量。由于藥物給藥劑量直接影響藥物間相互作用結(jié)果，因此后續(xù)在檢測(cè)方法靈敏度進(jìn)一步提高的情況下，可考慮在降低ATV給藥劑量的實(shí)驗(yàn)條件下繼續(xù)探討其聯(lián)合用藥后受到的影響，以更接近臨床實(shí)際用藥情況。

綜上，本研究結(jié)果表明，丹紅注射液聯(lián)合給藥可影響ATV在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為，即可增加ATV在大鼠體內(nèi)的暴露量?？紤]到實(shí)際用藥中兩藥的給藥次數(shù)、給藥劑量及人與大鼠對(duì)ATV代謝存在的種屬差異，因此有必要開(kāi)展后續(xù)研究以明確兩者在臨床上合并用藥時(shí)的藥動(dòng)學(xué)相互作用，以確保安全、合理用藥。