孫慧玲，何楠，史夢珺，Adel FahmiAhmed，李昌勤

（1.河南大學藥學院/河南省藥食兩用資源功能研究國際聯(lián)合實驗室，河南 開封 475004；2.開封市保健食品功效成分研究重點實驗室，河南 開封 475004；3.埃及國家農業(yè)研究中心藥用與芳香植物研究所，埃及 吉薩 12619）

紫荊（Cercis chinensis）為豆科紫荊屬植物，是一種常見的栽培植物，在全國各地均有分布[1]。紫荊作為傳統(tǒng)中藥，其花可用于治療鼻中疳瘡、風濕骨痛，其果可用于治療咳嗽，其樹皮可用于治療風濕寒痹、血氣疼痛、癰腫等[2-3]。相關文獻表明，紫荊屬植物中的化學成分有黃酮類、木脂素類以及二苯乙烯類等，其中以黃酮類化合物為主[4]。

隨著人們生活水平的提高，越來越多的女性對皮膚的白皙度十分關注。但是受紫外線照射、環(huán)境污染等因素的影響，會導致人體黑色素代謝異常、黑色素細胞分泌的黑色素增加并使局部皮膚變黑，從而發(fā)生雀斑和黃褐斑等色素沉著性疾病[5]。酪氨酸酶是一種含銅氧化酶，是黑色素細胞合成黑色素的關鍵性酶，而通過抑制酪氨酸酶活性，可減少黑色素的形成，從而發(fā)揮美白的功效[6-7]。因此，可通過考察藥物對酪氨酸酶活性的抑制作用來評價其美白效果。研究表明，紫荊屬植物中的黃酮類化合物對酪氨酸酶活性具有競爭性抑制作用[8-9]，如紫荊葉中就含有此類酪氨酸酶活性抑制成分[10]。

中藥成分復雜，要闡明某種成分與相應藥效活性的關系較為困難，而中藥譜效學能夠將中藥指紋圖譜和藥效學結合起來，既能標示出中藥含有的多種成分，又能很好地揭示成分與藥效的關系[11-13]。因此，中藥譜效學常用于闡明中藥中各成分對藥效的貢獻程度，其主要方法包括多元線性回歸分析法、偏最小二乘回歸分析法等[14]。本研究采用最小偏二乘回歸分析法，根據(jù)紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用，考察其特征圖譜所代表的不同成分對該抑制作用的貢獻程度，以期為篩選具有酪氨酸酶活性抑制作用的天然美白原料提供理論基礎和試驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀（包括DGU-20A5R在線脫氣機、LC-20AT輸液泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器及LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津公司）；Multiskan MK3型全波長酶標儀（美國Thermo Electron公司）；分樣篩（上虞市五四儀器廠）；TGL-16型高速離心機（金壇市中大儀器廠）；GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州翔天實驗儀器廠）。

1.2 試劑

左旋多巴對照品（上海Alfa Aesar公司，批號：10102261，純度：98%）；酪氨酸酶（美國Worthingto Biochemical公司，批號：33K14431，活性：1 050 U/mg）；冰醋酸（分析純）、甲醇（色譜純）均購自天津市大茂化學試劑廠；水為杭州娃哈哈集團有限公司純凈水。

1.3 藥材

紫荊葉采集于河南大學金明校區(qū)，每隔半個月采收一批，共16個批次（分別采收于2016年4月21日、5月4日、5月19日、6月3日、6月18日、7月3日、7月18日、8月2日，2017年4月19日、5月4日、5月19日、6月4日、6月19日、7月4日、7月19日、8月4日，批次編號依次為S1～S16），經河南大學藥學院李昌勤教授鑒定為紫荊屬植物紫荊（C.chinensis）的葉。標本存放于河南省藥食兩用資源功能研究國際聯(lián)合實驗室。

2 方法

2.1 紫荊葉提取物供試品溶液的制備

取干燥紫荊葉，粉碎后過70目篩，精密稱取粉末500 mg，置于10 mL EP管中，加入70%乙醇5 mL，在50℃水浴條件下加熱提取2 h；3 000 r/min離心3 min，取上清液用70%乙醇稀釋，依次得到100、50、25 mg/mL（按生藥計）的紫荊葉提取物供試品溶液。

2.2 紫荊葉提取物量化特征色譜圖的生成及共有峰的確定

采用HPLC法測定。色譜條件：色譜柱為InertSustain C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0→13 min，30%A→43%A；13→15 min，43%A→50%A；15→22 min，50%A；22→35 min，50%A→68%A）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為254 nm；進樣量為10 μL。

取16個批次紫荊葉，分別按“2.1”項下方法制備質量濃度為100 mg/mL（按生藥計）的紫荊葉提取物供試品溶液，進樣測定，得到相應色譜圖。以各批次供試品溶液的色譜圖為參照圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004（A版）》，設時間窗口為0.5，選擇各批次樣品中均含有的、含量相對較高且分離度較好的色譜峰位進行多點校正，采用峰面積平均數(shù)法生成量化特征色譜圖，并匹配共有峰。

2.3 紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制率測定

采用體外酪氨酸酶多巴速率氧化微量法[15]測定酪氨酸酶活性抑制率。（1）向96孔板中依次加入磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）45 μL、50%甲醇5 μL、0.2 U/mL酪氨酸酶溶液25 μL，30 ℃溫育10 min；然后加入0.5 mg/mL左旋多巴對照品溶液25 μL，振蕩混勻，30℃反應5 min。用酶標儀在492 nm波長處測定吸光度（A溶劑）。（2）用不同質量濃度的紫荊葉提取物供試品溶液（100、50、25 mg/mL）5 μL代替50%甲醇5 μL，按“（1）”項下方法操作，測定吸光度（A樣品）。（3）不加入酪氨酸酶，分別按“（1）”“（2）”項下方法操作，測定不加酶的溶劑空白組、不加酶的樣品空白組的吸光度（A溶劑空白、A樣品空白）。（4）按公式計算酪氨酸酶活性抑制率：抑制率（%）＝[（A樣品－A樣品空白）/（A溶劑－A溶劑空白）－1]×100%。

2.4 譜效關系的數(shù)據(jù)分析

采用偏最小二乘回歸分析法進行譜效分析。以紫荊葉提取物的量化特征圖譜中共有峰的峰面積為自變量（X）、紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制率為因變量（Y），采用DPS 7.05分析軟件建立偏最小二乘回歸方程，分別篩選出與酪氨酸酶活性抑制作用有顯著相關性的色譜峰。

3 結果

3.1 紫荊葉提取物特征色譜圖中的共有峰

16個批次紫荊葉提取物的特征色譜圖匹配出16個共有峰（分別命名為P1～P16）。其量化特征色譜圖見圖1。

圖1 16個批次紫荊葉提取物的量化特征色譜圖Fig 1 Quantitative characteristic chromatogram of the extract of 16 batches of C.chinensis leaves

3.2 紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制率

16個批次紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制率測定結果見表1。由表1可見，不同批次紫荊葉提取物的酪氨酸酶活性抑制率存在明顯差別；總體上看，其質量濃度越高，對酪氨酸酶活性的抑制作用越強，但其質量濃度與酶活性抑制率不呈線性相關性。

表1 16個批次紫荊葉提取物的酪氨酸酶活性抑制率Tab 1 Inhibition rate of 16 batches of the extract of C.chinensis leaves on tyrosinase activity

3.3 譜效關系分析結果

3.3.1 偏最小二乘回歸方程的建立 由表1可見，紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性抑制作用最強（即抑制率最高）的質量濃度為100 mg/mL，因此以該質量濃度紫荊葉提取物供試品溶液對應的酪氨酸酶活性抑制率作為因變量（Y）進行偏最小二乘回歸分析。數(shù)據(jù)經標準化處理后模型誤差平方和隨著潛在因子的增加而逐漸增大，當潛在因子達到3時，誤差平方和達到最大值，此時得到回歸方程：Y＝－0.047 423X1－0.150 273X2－0.056 010X3－0.236 157X4+0.173 663X5+0.045 081X6+0.071 250X7+0.139 081X8－0.056 328X9+0.216 580X10+0.082 024X11+0.160 168X12－0.032 678X13－0.038 361X14+0.344 516X15+0.103 491X1（6注：Y表示酪氨酸酶抑制率，Xi表示各共有峰峰面積）。特征共有峰-酪氨酸酶活性抑制率的偏最小二乘回歸模型標準化回歸系數(shù)圖見圖2。

圖2 特征共有峰-酪氨酸酶活性抑制率的偏最小二乘回歸模型標準化回歸系數(shù)圖Fig 2 Standardization regression coefficient of PLSR model of characteristics common peak-tyrosinase inhibition activity

3.3.2 酶活性抑制作用相關的特征共有峰的確定 由圖2可知，P5、P8、P10、P12、P15、P16號共有峰與紫荊葉提取物的酪氨酸酶活性抑制作用呈正相關，且相關系數(shù)較大（R＞0.1）[16]，這提示當這些峰代表的化合物含量增加時，紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用增強；P2、P4號共有峰與紫荊葉提取物的酪氨酸酶活性抑制作用呈負相關，且相關系數(shù)的絕對值較大（│R│＞0.1）[16]，這提示當這些峰代表的化合物含量增加時，紫荊葉提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用減弱。

4 討論

中藥成分復雜多樣，在其物質基礎研究過程中會得到大量數(shù)據(jù)，而計算機強大的編程和建模功能可為其復雜的物質基礎研究提供可靠而有力的幫助。李戎等[17]在2002年正式提出了“譜效關系”的概念，指出將中藥指紋圖譜與藥效聯(lián)系起來，建立與中藥療效基本一致的成分控制質量標準。而用于譜效關系數(shù)據(jù)處理的偏最小二乘回歸分析法，是一種包括了多因變量對多自變量的回歸建模以及主成分分析在內的多元數(shù)據(jù)分析方法，具有計算量小、預測精度高、無需剔除樣本點、易于定性解釋等優(yōu)點，能最大限度地利用有限的數(shù)據(jù)信息，并具有較好的預測性[18]。目前，中藥譜效關系主要應用于控制不同產地、來源、采收期、批次中藥飲片的質量[19-24]。

本研究對紫荊葉提取物的化學成分進行HPLC分析前，在預試驗中曾采用二極管陣列檢測器對紫荊葉提取物進行全波長掃描。結果顯示，檢測波長為254 nm時所獲得的HPLC圖譜信息比較豐富、基線較為平穩(wěn)、整體吸收強度較為均衡，因此選擇254 nm為檢測波長。

本研究對紫荊葉提取物的酪氨酸酶活性抑制作用考察顯示，不同采收時期的紫荊葉樣品的提取物對酪氨酸酶活性的抑制率存在明顯差別，且提取物濃度與其酶活性抑制率不呈線性相關性。這提示紫荊葉中存在多種可影響酪氨酸酶活性的化學成分，有的可抑制酪氨酸酶，有的可激活酪氨酸酶，有的可能具有雙向調節(jié)作用。

本研究通過譜效關系分析證實，紫荊葉提取物質量濃度為100 mg/mL（以生藥計）時，P5、P8、P10、P12、P15、P16號共有峰與其對酪氨酸酶活性的抑制作用呈正相關，P2、P4號共有峰與其對酪氨酸酶活性的抑制作用呈負相關。但上述共有峰面積（代表化合物的含量）與酪氨酸酶活性抑制作用的正/負相關性只能表示其作用趨勢，并不表示這些化合物直接對酪氨酸酶活性起抑制或激活作用；且譜效關系分析是以各個峰作為獨立樣本為假設前提，而忽略了不同化合物之間的相互作用。因此，這些特征色譜峰所代表的化合物的結構仍需進一步鑒定，化合物之間的相互作用仍需進一步深入探索。