侯錫鴻，葛梅，張迎春，曾忠良

（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）

牡丹皮為毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的干燥根皮[1]，其主要活性成分為以丹皮酚為主的酚酸類和以芍藥苷為主的苷類[2]。牡丹皮具有清熱涼血、活血化瘀的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病等作用[3]，含有該藥材的六味地黃丸是其臨床應(yīng)用的典范。

牡丹皮以重慶墊江產(chǎn)（習(xí)稱“川丹”）、安徽銅陵和鳳陽(yáng)產(chǎn)（習(xí)稱“鳳丹”）的質(zhì)量較優(yōu)[4]，但因其基源植物牡丹集觀賞性和藥用于一體，在近年大力發(fā)展觀光農(nóng)業(yè)、大面積種植觀賞牡丹的情況下，市售牡丹皮藥材的產(chǎn)地及來(lái)源極其復(fù)雜、質(zhì)量良莠不齊，其藥用效果和臨床用藥安全也受到極大影響。2015年版《中國(guó)藥典》（一部）牡丹皮的質(zhì)量控制指標(biāo)項(xiàng)下也僅有丹皮酚含量測(cè)定，顯然難以全面反映該藥材真實(shí)的內(nèi)在質(zhì)量。

指紋圖譜技術(shù)能較全面地反映中藥的特征化學(xué)信息，在樣品真?zhèn)舞b別評(píng)價(jià)等方面表現(xiàn)出較大的優(yōu)勢(shì)[5]，且該技術(shù)與中醫(yī)藥整體觀相符，目前已成為國(guó)際公認(rèn)的中藥及天然藥物質(zhì)量控制技術(shù)[6]。在目前牡丹皮基源植物育種背景不清楚、藥材質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)體系不完善的大環(huán)境下，已有的相關(guān)檢驗(yàn)鑒別技術(shù)專屬性差等問(wèn)題已顯露[7-10]。為此，筆者對(duì)重慶墊江、安徽銅陵和亳州等地采集以及市售的共69批牡丹皮藥材樣品進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究，以期為該藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD型HPLC儀（包括DGU-20A3R脫氣機(jī)、LC-20AD溶液輸送單元、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution色譜工作站）、LCMS-8030型HPLC-質(zhì)譜（MS）儀、AUW220D型十萬(wàn)分之一電子分析天平均購(gòu)自日本Shimadzu公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；CS-700型高速多功能粉碎機(jī)（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）。

1.2 試劑

丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)：150722，純度：＞98%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：150819，純度：＞98%）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：150729，純度：＞98%）、沒(méi)食子酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：150903，純度：＞98%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：YY90574-201703，純度：＞98%）、苯甲酰氧化芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：BWB51073-201704，純度：＞98%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹皮酚原苷對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：D-019-150925，純度：＞99%）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

69批牡丹皮藥材樣品由筆者自采或購(gòu)買（來(lái)源見(jiàn)表1），經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院陳前鋒副教授鑒定為真品。

表1 牡丹皮藥材來(lái)源Tab 1 Sources of P.suffruticosa

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Ecosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子模式檢測(cè)；掃描范圍：m/z100～1 200；干燥氣：N2（純度：99.999 9%）；干燥氣流速：15 L/min；干燥氣溫度：350℃；碰撞低能量：4 V；碰撞高能量：10～40 V。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取丹皮酚、芍藥苷、沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、沒(méi)食子酸甲酯、丹皮酚原苷、苯甲酰氧化芍藥苷對(duì)照品各適量，加甲醇分別制成單一對(duì)照品貯備液；分別精密量取上述單一對(duì)照品貯備液各0.8 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容搖勻，制成每1 mL含0.266 mg丹皮酚、0.798 mg芍藥苷、0.884 mg沒(méi)食子酸、1.393 mg氧化芍藥苷、0.143 mg沒(méi)食子酸甲酯、0.096 mg丹皮酚原苷、0.090 mg苯甲酰氧化芍藥苷的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品適量，粉碎后過(guò)80目篩；取粉末0.5 g，精密稱定，置于50 mL量瓶中，精密加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：700 W，頻率：40 kHz）提取30 min；取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻；經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S19）適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以丹皮酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.37%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為0.54%～3.53%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S19）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以丹皮酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.32%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為0.47%～4.65%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品（編號(hào)：S19）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以丹皮酚峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，29個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0～0.62%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD為1.47%～4.97%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC-MS指紋圖譜分析

2.4.1 HPLC-MS指紋圖譜的生成 取69批藥材樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》對(duì)69批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 69批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprint of 69 batches of samples

圖2 藥材樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC reference fingerprint of samples

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》，以生成的HPLC對(duì)照指紋圖譜為對(duì)照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，69批藥材樣品中，除6批的相似度小于0.900外，其余63批的相似度均大于0.900，表明大部分藥材樣品間差異較小、質(zhì)量穩(wěn)定性較好，詳見(jiàn)表3。

表3 69批藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 3 Similarity evaluation of 69 batches of samples

2.4.3 共有峰的指認(rèn)及相關(guān)分析 根據(jù)MS離子峰及碎片信息與保留時(shí)間，綜合對(duì)照品MS信息及文獻(xiàn)報(bào)道的MS數(shù)據(jù)[11-14]對(duì)藥材樣品的指紋圖譜中的共有峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)歸屬的初步判斷。通過(guò)與混合對(duì)照品MS圖譜的離子峰信息進(jìn)行比對(duì)，確定峰4、8、9、11、14、24、25分別是沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、沒(méi)食子酸甲酯、丹皮酚原苷、芍藥苷、苯甲酰氧化芍藥苷、丹皮酚；推測(cè)鑒定出了29個(gè)共有峰，詳見(jiàn)表4。

2.5 聚類分析

以各共有峰相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件，以歐氏距離分層聚類法中的Ward法對(duì)69批藥材樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，詳見(jiàn)圖3。由圖3可知，取歐氏距離為10時(shí)，69批藥材樣品可聚為5類：S4～S6為重慶墊江太平鎮(zhèn)生長(zhǎng)年限在17年及以上的藥材樣品，與其他藥材樣品有顯著差異，相似度均小于0.800，和S41聚為第Ⅱ類；采自重慶墊江太平鎮(zhèn)的S1～S3栽培品和采自安徽的S7～S9栽培品除S3外其他相似度均大于0.900，同S10、S12、S24、S25、S54、S59聚為第Ⅲ類；市售藥材樣品主要聚為第Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ類。

3 討論

在預(yù)試驗(yàn)中，筆者比較了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇（60%、70%、80%、90%）作為提取溶劑時(shí)的提取效率。結(jié)果，采用70%甲醇作為提取溶劑時(shí)，色譜峰數(shù)量較多，峰面積響應(yīng)好，故選擇70%甲醇作為提取溶劑。因丹皮酚為易揮發(fā)性物質(zhì)，故提取方法選擇超聲提取。筆者考察了不同超聲提取時(shí)間（15、30、45、60 min）對(duì)提取效率的影響，結(jié)果30 min的提取效率優(yōu)于15 min，而再延長(zhǎng)提取時(shí)間后提取效率無(wú)明顯差別，因此選擇30 min作為提取時(shí)間。

表4 藥材樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜中各共有峰對(duì)應(yīng)成分的推測(cè)鑒定結(jié)果Tab 4 Speculativeness and identification of corresponding components of the peaks in HPLC reference fingerprint of samples

圖3 聚類分析樹狀圖Fig 3 Hierarchical cluster dendritic diagram

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)69批牡丹皮藥材樣品進(jìn)行分析，并推測(cè)鑒定出29個(gè)共有峰的對(duì)應(yīng)成分，主要是單萜苷類、酚酸類及黃酮類成分，這些共有成分可作為對(duì)牡丹皮藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

69批藥材樣品中有3批（S1～S3）為重慶墊江產(chǎn)的2年生的自采樣品，3批（S4～S6）為重慶墊江產(chǎn)的17年以上的自采樣品，3批（S7～S9）為安徽產(chǎn)的4年生的自采樣品。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，生長(zhǎng)年限在17年及以上的藥材樣品（S4～S6）的相似度均小于0.900，而其余市售或自采樣品（除S21、S55外）相似度大部分均大于0.900，反映了生長(zhǎng)年限在3～5年的藥材樣品質(zhì)量更穩(wěn)定。聚類分析中生長(zhǎng)年限在17年及以上的藥材樣品（S4～S6）和S41聚為一類，顯示出與其他藥材樣品有明顯差異。重慶墊江另外3個(gè)自采樣品（S1～S3）和安徽的自采樣品（S7～S9）能聚為一類，顯示兩個(gè)產(chǎn)地品種質(zhì)量的相似性。而市售其他藥材樣品主要聚為另外3類，且相似度大多大于0.900，提示市售藥材樣品化學(xué)成分整體上較為穩(wěn)定，但也會(huì)受到產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、加工方式、貯藏條件和時(shí)間等多種因素影響而產(chǎn)生一定波動(dòng)[15-20]。

綜上所述，本研究所建HPLC指紋圖譜、成分鑒定和聚類分析結(jié)果可為牡丹皮藥材的真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。