李佳興，周 利，金 艷，余 意，馬方勵(lì)，楊 健，郭蘭萍，2#

[1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心/道地藥材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100700；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510006；3.無(wú)限極（中國(guó)）有限公司，廣州 510663]

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目的功效，主要用于虛勞精虧、腰膝酸痛、眩暈耳鳴、陽(yáng)痿遺精、內(nèi)熱消渴、血虛痿黃、目昏不明等癥的治療[1-2]。研究結(jié)果顯示，枸杞子含有多糖、有機(jī)酸、黃酮、氨基酸、維生素和微量元素等[3-4]，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫力等作用[5-8]。

有機(jī)酸類成分是中藥中酸味的主要來(lái)源，中醫(yī)五味講“酸入肝”“酸收斂”，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸類成分具有抗炎、抗血栓、抑制血小板凝聚等多種藥理活性[9-11]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞子中含有草酸、酒石酸等多種有機(jī)酸[12]，但目前其相關(guān)含量測(cè)定研究較少見(jiàn)。本研究采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)不同產(chǎn)地的枸杞子藥材中水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸等12種有機(jī)酸類成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，并進(jìn)行了成分含量差異分析，以期為枸杞子的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AB SCIEX 6500型質(zhì)譜儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、EmpowerTM色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MM型400混合球磨儀（德國(guó)Retsch公司）；DHG-9145AZ型電熱干燥箱（上海恒科儀器有限公司）；New Classic MS-S型電子分析天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；5810R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 試劑

咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：K003161216，純度：≥98%）、對(duì)香豆酸對(duì)照品（批號(hào)：RD794160825，純度：≥98%）、富馬酸對(duì)照品（批號(hào)：F016170426，純度：≥98%）、3，4-二羥基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：RY568160920，純度：≥98%）、酒石酸對(duì)照品（批號(hào)：J065161216，純度：≥98%）均購(gòu)自北京融誠(chéng)鑫德科技發(fā)展有限公司；香草酸對(duì)照品（批號(hào)：S27M7115319，純度：≥98%）、對(duì)羥基苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：MKBK3576V，純度：≥98%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：16051311，純度：≥98%）、丁香酸對(duì)照品（批號(hào)：S23F7K9842，純度：≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；原兒茶酸對(duì)照品（上海同田生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：15050521，純度：≥98%）；水楊酸對(duì)照品（批號(hào)：PS1136-0025，純度：≥98%）、肉桂酸對(duì)照品（批號(hào)：PS0094-0100，純度：≥98%）均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

枸杞子藥材采自寧夏、青海、甘肅、新疆等枸杞子主產(chǎn)區(qū)，共15批（見(jiàn)表1），經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷副研究員鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B→25%B；1～3.5 min，25%B→40%B；3.5～4.5 min，40%B→50%B）；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：Turbo VTM離子源；電離模式：電噴霧離子化（ESI－）；氣簾氣體積流量：30 L/min；噴霧電壓：－4 500 V；霧化氣體積流量：50 L/min；加熱輔助氣體積流量：50 L/min；掃描方式：質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；離子化溫度：550℃。優(yōu)化的條件參數(shù)見(jiàn)表2，提取離子流圖見(jiàn)圖1。

表1 枸杞子藥材來(lái)源Tab 1 Sources of L.barbarum

表2 優(yōu)化的條件參數(shù)Tab 2 Optimized conditional parameters

圖1 提取離子流圖Fig 1 Extraction ion flow graph

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取各待測(cè)成分對(duì)照品適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述單一對(duì)照品貯備液各適量，用甲醇分組制成含水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、富馬酸質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液和含3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸、原兒茶酸質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品細(xì)粉（過(guò)4號(hào)篩）50 mg，置于2 mL離心管中，精密加入甲醇1.5 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，12 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下單一對(duì)照品貯備液各適量，用甲醇稀釋制成系列單一對(duì)照品溶液。精密量取上述系列單一對(duì)照品溶液各1.0 μL，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度。以各待測(cè)成分的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、離子信號(hào)強(qiáng)度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程和線性范圍見(jiàn)表3。

表3 回歸方程、線性范圍、定量限、檢測(cè)限考察結(jié)果Tab 3 Results of regression equations，linear ranges，limit of quantity and limit of detection

2.4 定量限與檢測(cè)限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，用甲醇倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比10∶1、3∶1計(jì)算定量限、檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果，水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸離子信號(hào)強(qiáng)度的RSD分別為0.48%、0.74%、0.78%、0.96%、0.88%、0.61%、0.52%、0.64%、0.56%、0.95%、0.96%、0.60%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：11）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果，水楊酸、香草酸、肉桂酸、咖啡酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、富馬酸、3，4-二羥基苯甲酸、酒石酸、丁香酸和原兒茶酸離子信號(hào)強(qiáng)度的RSD分別為1.42%、0.81%、2.00%、1.43%、2.42%、1.36%、1.06%、1.97%、1.58%、1.68%、1.19%、2.31%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥材樣品（編號(hào)：11）細(xì)粉適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的藥材樣品（編號(hào)：11）細(xì)粉適量，每份0.1 g，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的單一對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4Results of reproducibility tests（n＝6）

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 5Results of recovery tests（n＝6）

續(xù)表5Continued tab 5

2.9 樣品中有機(jī)酸類成分含量測(cè)定及分析

取各批藥材樣品適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄離子信號(hào)強(qiáng)度并計(jì)算藥材樣品中有機(jī)酸類成分含量，然后進(jìn)行成分含量差異分析和相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表6～表9。由表6可知，15批藥材樣品中總有機(jī)酸平均含量為147.74 μg/g，其中以對(duì)香豆酸平均含量最高，達(dá)76.35 μg/g；阿魏酸、酒石酸和富馬酸平均含量分別為19.25、16.50、15.74 μg/g；對(duì)羥基苯甲酸和肉桂酸平均含量較低，分別為8.13、4.90 μg/g；丁香酸平均含量最低，為0.17 μg/g。由表7可知，新疆產(chǎn)區(qū)所產(chǎn)藥材樣品中總有機(jī)酸平均含量最高，達(dá)209.21 μg/g；其次為青海產(chǎn)區(qū)樣品，含量達(dá)154.31 μg/g；甘肅和寧夏產(chǎn)區(qū)樣品含量較低。由表8可知，從品種看，寧杞七號(hào)總有機(jī)酸含量略高，達(dá)153.70 μg/g，其中對(duì)香豆酸平均含量為80.64 μg/g；寧杞五號(hào)總有機(jī)酸平均含量略低，為140.94 μg/g，其中對(duì)香豆酸平均含量為71.44 μg/g。由表9可知，香草酸含量與對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸和丁香酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；肉桂酸含量與富馬酸和酒石酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；咖啡酸含量與阿魏酸、酒石酸和丁香酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；對(duì)羥基苯甲酸含量與丁香酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；阿魏酸含量與丁香酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；3，4-二羥基苯甲酸含量與原兒茶酸含量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論

本課題組采用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定了枸杞子藥材樣品中12種有機(jī)酸類成分的含量，由試驗(yàn)結(jié)果可知，不同批次的枸杞子藥材樣品中總有機(jī)酸和12種有機(jī)酸類成分含量差異較大。推測(cè)其原因除了品種這一遺傳因素外，不同產(chǎn)區(qū)的地理?xiàng)l件、土壤成分、氣候特征、光照強(qiáng)度等生態(tài)因子也極大地影響了相關(guān)有機(jī)酸成分的積累[13-14]。

枸杞子藥材樣品中各有機(jī)酸類成分含量之間相關(guān)性分析顯示，多種有機(jī)酸達(dá)到極顯著正相關(guān)。中藥的功效是多種成分共同作用的結(jié)果，與其不同成分的含量和比例相關(guān)，因此根據(jù)本研究結(jié)果中枸杞子藥材中各有機(jī)酸類成分含量的相關(guān)性有助于進(jìn)一步分析該類成分與復(fù)雜藥效的關(guān)系。

表6 藥材樣品中有機(jī)酸類成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg/g）Tab 6Content determination results of organic acids in samples（n＝3，μg/g）

表7 不同產(chǎn)區(qū)藥材樣品中有機(jī)酸類成分平均含量比較（μg/g）Tab 7Comparison of the average contents of organic acids in samples from different production areas（μg/g）

表8 不同品種藥材樣品中有機(jī)酸類成分平均含量比較（μg/g）Tab 8Comparison of the average contents of organic acids in samples with different types（μg/g）

表9 藥材樣品中各有機(jī)酸類成分含量之間的相關(guān)性Tab 9 Correlation of different organic acids in samples

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定枸杞子藥材中12種有機(jī)酸類成分含量。不同產(chǎn)區(qū)、品種藥材樣品中有機(jī)酸類成分含量有所不同，且某些成分間有一定的相關(guān)性。