劉 濤, 鄭 燕, 楊 丹， 曹 鑫, 楊俊莉, 張 佳, 徐玉玲

(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1].研究表明，金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱、保肝、降血脂及抗化免疫調(diào)節(jié)等作用[2].山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1].研究發(fā)現(xiàn)，山銀花具有抑菌、抗病毒、抗過(guò)敏和肝臟保護(hù)等作用[3].

《中國(guó)藥典》自2005年版起將金銀花和山銀花分為兩個(gè)品種收載.在南方大部分地區(qū)，民間仍然習(xí)慣將山銀花稱(chēng)為金銀花.在藥材市場(chǎng)，山銀花常被用來(lái)替代金銀花入藥，但《中國(guó)藥典》2015版規(guī)定，只有忍冬為金銀花的惟一合法來(lái)源.針對(duì)金銀花與山銀花中的差異，科研人員進(jìn)行了相關(guān)的研究，取得了一系列成果[4-6].在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)建立金銀花與山銀花的紫外—可見(jiàn)與紅外指紋圖譜，在不同波長(zhǎng)下對(duì)二者成分及其官能團(tuán)進(jìn)行分析，完善了金銀花與山銀花質(zhì)量控制差異的研究方法.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用的材料包括：無(wú)水乙醇(批號(hào)，2016102401)、石油醚(批號(hào)，2016091301)、甲醇(批號(hào)，2017010501)，均購(gòu)自成都科龍化工試劑廠，溴化鉀(批號(hào)，20170526)，購(gòu)自天津卒越化學(xué)品有限公司；水為藍(lán)光純凈水；金銀花、山銀花藥材購(gòu)置于不同中藥店，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院李青苗副研究員鑒定，藥材金銀花為忍冬，藥材山銀花為灰氈毛忍冬，樣品來(lái)源分別見(jiàn)表1、2.

表1 金銀花藥材來(lái)源

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：TU-1810PC型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Spectrum Tow型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；BS-6KH型電子天平(上海友聲衡器有限公司)；FW-5型壓片機(jī)(天津博天勝達(dá)科技發(fā)展有限公司)；LD510-2R型電子天平(沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)；HS-3120型超聲清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (常州國(guó)華電器有限公司).

表2 山銀花藥材來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外—可見(jiàn)指紋圖譜

2.1.1 供試品溶液制備.

取金銀花、山銀花粉末各約0.6 g，精密稱(chēng)定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理 30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得.

2.1.2 測(cè)試條件.

以甲醇調(diào)整基線并作為參比液進(jìn)行紫外—可見(jiàn)光譜測(cè)定，設(shè)定掃描波長(zhǎng)為200～900 nm，掃描速度 200 nm/min，狹縫寬1.5 nm，采樣間隔2 nm.

2.1.3 方法學(xué)考察.

按“2.1.1"項(xiàng)下方法制備金銀花供試品溶液1份，取供試品溶液，利用波長(zhǎng)為200～900 nm的光譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到圖譜后，用樣品的吸收波長(zhǎng)計(jì)算平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，測(cè)得精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察項(xiàng)下紫外—可見(jiàn)圖譜波長(zhǎng)在329 nm、265 nm、242 nm、230 nm、217 nm處的RSD均小于5.0%.結(jié)果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均良好.

2.1.4 金銀花與山銀花紫外—可見(jiàn)光譜采集.

分別取10批金銀花藥材粉末與10批山銀花藥材粉末，按照“2.1.1"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.2"項(xiàng)下條件測(cè)定.10批金銀花藥材疊加圖譜見(jiàn)圖1，10批山銀花藥材疊加圖譜見(jiàn)圖2.

2.1.5 金銀花對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜的建立.

選擇在前期研究中進(jìn)行構(gòu)建指紋圖譜的10批金銀花樣品(編號(hào)，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10)，以其吸收波長(zhǎng)下，吸光度的平均值為對(duì)照指紋圖譜的吸收強(qiáng)度，得到對(duì)照紫外—可見(jiàn)圖譜如圖3所示.

圖1 10批金銀花紫外—可見(jiàn)光譜疊加圖

圖2 10批山銀花紫外—可見(jiàn)光譜疊加圖

圖3金銀花對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜

2.1.6 樣品指紋圖譜相似度分析.

將山銀花樣品的紫外—可見(jiàn)圖譜與得到的對(duì)照紫外—可見(jiàn)指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，采用相關(guān)系數(shù)法[7-8]進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 相似度分析結(jié)果

由表3可知，山銀花指紋圖譜與金銀花對(duì)照指紋圖譜的相似度在96.4%～98.7%范圍內(nèi).此表明，金銀花藥材與山銀花藥材的內(nèi)在質(zhì)量有較高的相似性.

2.1.7 結(jié)果分析.

由圖1、圖2可以觀察到，金銀花的吸光度范圍大致在0.214～1.098之間，山銀花的吸光度范圍大致在0.150～1.400之間，并且金銀花與山銀花在波長(zhǎng)329 nm處都有一波峰，在波長(zhǎng)265 nm處都有一波谷，金銀花在波長(zhǎng)230 nm、242 nm處有一波峰，山銀花在這兩處峰形不太明顯，但兩藥材在波長(zhǎng)217 nm處都有一波峰.

研究證實(shí)，在波長(zhǎng)329 nm處有特征吸收峰的是亞異丙基丙酮類(lèi)化合物，在波長(zhǎng)230 nm處有特征吸收峰的是芳香族化合物，在波長(zhǎng)242 nm處有特征吸收波峰的是甾體類(lèi)化合物，在波長(zhǎng)217 nm處有特征吸收峰的是1,3-己二烯類(lèi)化合物.此表明，金銀花與山銀花都含有亞異丙基丙酮類(lèi)化合物和1,3-己二烯類(lèi)化合物；金銀花含有甾體類(lèi)化合物和芳香族化合物，但山銀花可能含有少量或不含有.

2.2 紅外指紋圖譜

首先測(cè)定金銀花、山銀花藥材粉末紅外指紋圖譜，再以不同極性的甲醇、水、石油醚為溶媒制備供試品溶液，再測(cè)定其紅外指紋圖譜，目的是排除不同極性溶媒對(duì)圖譜產(chǎn)生的影響.由于紫外—可見(jiàn)指紋圖譜供試品制備以甲醇為溶媒，最后選擇以甲醇為溶媒的金銀花與山銀花紅外指紋圖譜進(jìn)行共有峰率及變異峰率的分析，目的是排除溶媒對(duì)兩種分析方法產(chǎn)生的影響.

2.2.1 金銀花與山銀花粉末紅外圖譜采集.

分別取適量金銀花、山銀花藥材粉末于瑪瑙乳缽中，加入100 mg溴化鉀粉末研磨均勻，取適量研細(xì)后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測(cè)定紅外光譜，測(cè)定區(qū)域?yàn)?50～4 000 cm-1.

2.2.2 3種提取溶媒下供試品紅外圖譜采集.

取金銀花、山銀花粉末各約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別平行3份，分別精密加入石油醚、甲醇、水25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用相應(yīng)的溶媒補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，制得供試品溶液.取20 μL供試品溶液于瑪瑙乳缽中，揮干，加入100 mg 溴化鉀粉末研磨均勻，取適量研細(xì)后的粉末平鋪于紅外壓片模具中，以15 MPa壓力壓制2 min，將制備好的樣片置于紅外光譜儀中測(cè)定紅外光譜，測(cè)定區(qū)域?yàn)?50～4 000 cm-1.

2.2.3 方法學(xué)考察.

取金銀花樣品(批號(hào)，170319)4份，按照“2.2.1"及“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，并進(jìn)行測(cè)定，取所得圖譜中吸收強(qiáng)度最強(qiáng)的6個(gè)對(duì)應(yīng)波數(shù)作為特征吸收波數(shù).經(jīng)考察，測(cè)得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性項(xiàng)下各特征峰波數(shù)值RSD均小于1.5%.結(jié)果表明，方法的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性均符合要求.

2.2.4 金銀花與山銀花紅外圖譜采集及數(shù)據(jù)分析.

將10批金銀花與山銀花藥材粉末按“2.2.1”及“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，得到不同的金銀花與山銀花紅外指紋圖譜如圖4所示.

cm-1

圖4不同處理方法下金銀花與山銀花紅外光譜疊加圖

圖4中，10批金銀花與山銀花藥材直接壓片的紅外光譜疊加圖譜，見(jiàn)圖4(H1)、(H2)；石油醚為提取溶媒的10批金銀花與山銀花藥材紅外光譜疊加圖譜，見(jiàn)圖4(H3)、(H4)；甲醇為提取溶媒10批金銀花與山銀花藥材的紅外光譜疊加圖譜，見(jiàn)圖4(H5)、(H6)；水為提取溶媒10批金銀花與山銀花藥材的紅外光譜疊加圖譜，見(jiàn)圖4(H7)、(H8).

由圖4可知：在1 700～700 cm-1指紋區(qū)，藥材粉末直接壓片光譜的吸收峰強(qiáng)度強(qiáng)于溶劑提取物，石油醚提取物吸收峰強(qiáng)度弱于甲醇與水提取物；在3 700～3 000 cm-1指紋區(qū)，石油醚提取物吸收峰強(qiáng)度弱于甲醇與水提取物，甲醇與水提取物吸收峰強(qiáng)度較弱于藥材粉末直接壓片；金銀花與山銀花的不同極性提取物圖譜基本相似.產(chǎn)生以上結(jié)果的原因可能是由于3種溶媒極性差異所致，石油醚極性較弱，提取效率較低，甲醇與水極性較強(qiáng)，但較藥材粉末直接壓片，存在較大差異，表明甲醇與水不能將藥材中有效成分提取完全.在紅外光譜中，不同溶媒提取的金銀花與山銀花藥材無(wú)明顯差異，此表明，不同溶媒提取的金銀花與山銀花有效成分基本相似.

由圖4(H1)～(H8)可見(jiàn)，在3 400 cm-1、2 900 cm-1、1 600 cm-1、1 000 cm-1、2 000 cm-1區(qū)域附近都存在波谷，在1 500 cm-1、1 200 cm-1、880 cm-1域附近都存在波峰，且金銀花紅外指紋圖譜與山銀花紅外指紋圖譜存在的波峰波谷基本相似，此表明金銀花藥材與山銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量基本相似.經(jīng)查閱資料，金銀花中主要的成分是綠原酸、木犀草苷.綠原酸屬于酚酸類(lèi)，而木犀草苷屬于黃酮類(lèi)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)式的官能團(tuán)-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，可以把其紅外光譜圖分為3 400～2 800 cm-1、1 800～1 100 cm-1、1 100～450 cm-13個(gè)區(qū)段來(lái)研究[9].據(jù)圖4(H1)～(H8)可知，在金銀花與山銀花藥材中，都含有-OH、-CH2、-C=C、-C-O、-C=O，且成分與含量沒(méi)有明顯差異.

2.2.5 甲醇為提取溶媒的金銀花與山銀花藥材紅外指紋圖譜數(shù)據(jù)分析.

共有峰定義為在相互比較的2個(gè)紅外指紋圖譜中都出現(xiàn)的一組吸收峰，且組內(nèi)吸收峰的最大波數(shù)差顯著小于其與相鄰組之間的平均波數(shù)差，反之則為變異峰.共有峰率和變異峰率[10]的表達(dá)式為，

Na=Ng+na，Nb=Ng+nb，

式中，Na為指紋圖譜a的總峰數(shù)；Nb為指紋圖譜b的總峰數(shù)；na為紅外指紋圖譜a的變異峰數(shù)；nb為紅外指紋圖譜b的變異峰數(shù)；Ng為共有峰數(shù)；P為共有峰率；Nd為獨(dú)立峰數(shù)；Pva為指紋圖譜a的變異峰率；Pvb為指紋圖譜b的變異峰率.

5批金銀花樣品基本關(guān)系組與對(duì)如下：

(1)R1∶r1 (25.0,162.5,237.5)，R1∶r2(23.5,150.0,275.0)，R1∶r3(30.4,200.0,128.6)，R1∶r4(18.8,133.3,400.0)，R1∶r5(32.0,100.0,212.5)

(2)R2∶r1(50.0,30.0,170.0)，R2∶r2(36.0,44.4,233.3)，R2∶r3(64.3,44.4,111.1)，R2∶r4(40.6,0,246.2)，R2∶r5(40.9,44.4,200.0)

(3)R3∶r1(55.6,20.0,160.0)，R3∶r2(30.8,50.0,275.0)，R3∶r3(81.8,33.3,88.9)，R3∶r4(31.4,9.1,309.1)，R3∶r5(52.6,20.0,170.0)

(4)R4∶r1(210.0,19.0,28.6)，R4∶r2(65.2,60.0,93.3)，R4∶r3(75.0,100.0,33.3)，R4∶r4(77.8,14.2,114.3)，R4∶r5(94.0，41.2,64.7)

(5)R5∶r1(38.5,90.0,170.0)，R5∶r2(100.0,12.5,87.5)，R5∶r3(66.7,80.0,70.0)，R5∶r4(58.6,5.9,164.7)，R5∶r5(60.0,50.0,166.7).

其中，R1∶r1(25.0,162.5,237.5)，R1與r1的共有峰率為25.0%，R1相對(duì)于r1的變異峰率為162.5%，即金銀花變異峰率為162.5%，r1相對(duì)于R1的變異峰率為237.5%，即山銀花變導(dǎo)峰率為237.5%.

在(1)組中，上述試驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花樣品R1與山銀花r1～r5的相似度較低，共有峰均小于35%，且每組數(shù)據(jù)中金銀花變異峰率與山銀花變異峰率均大于共有峰率，表明金銀花樣品R1與山銀花樣品r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量差異較大；第(2)組與第(3)組共有峰最大值為81.8%，每組數(shù)據(jù)中金銀花與山銀花變異峰率至少一項(xiàng)大于共有峰率.表明金銀花樣品R2、R3與山銀花樣品r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量差異較大；在第(4)組與第(5)組中，除R4∶r1組與R5∶r2組共有峰率大于100.0%外，其余每組數(shù)據(jù)中金銀花與山銀花變異峰率至少一項(xiàng)大于共有峰率.表明金銀花樣品R4、R5與山銀花樣品r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量存在差異，但較金銀花樣品R1～R3與山銀花樣品r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量差異小.

通過(guò)計(jì)算5批金銀花與山銀花藥材的共有峰率與變異峰率發(fā)現(xiàn)，不同批號(hào)金銀花藥材與山銀花藥材的共有峰率與變異峰率大小不一.數(shù)據(jù)(1)～(3)組的分析結(jié)果表明，金銀花藥材R1～R3與山銀花藥材r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量存在較大差異；數(shù)據(jù)(4)～(5)組的分析結(jié)果表明，金銀花藥材R4、R5與山銀花藥材r1～r5的內(nèi)在質(zhì)量存在差異，但內(nèi)在質(zhì)量差異較金銀花藥材R1～R3與山銀花藥材r1～r5小.可以認(rèn)為，金銀花、山銀花藥材的質(zhì)量差異來(lái)源于金銀花與山銀花藥材自身存在的差異.因此，以化學(xué)成分或單個(gè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜比較金銀花和山銀花的差異應(yīng)該考慮藥材自身的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，而目前已有的研究文獻(xiàn)缺少對(duì)這方面的分析.

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)構(gòu)建金銀花與山銀花樣品紫外—可見(jiàn)指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，金銀花藥材與山銀花藥材的內(nèi)在質(zhì)量基本相似.紅外光譜分析表明，金銀花藥材與山銀花藥材的內(nèi)在質(zhì)量存在一定差異.本研究認(rèn)為，目前金銀花與山銀花藥材的質(zhì)量控制仍不夠完善，在臨床用藥時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)兩者的相關(guān)檢控.同時(shí)，本研究所用方法可為其他種屬相近的中藥材之間的對(duì)比研究提供新的思路.