雨 田， 練心潔， 孫佑玲， 劉 鳳， 張艷容， 周 濃

(1.成都大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 四川 成都 610106； 2.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610106；3.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院， 重慶 404000)

0 引 言

浙貝母為百合科貝母屬植物，以其干燥鱗莖入藥，是浙江道地藥材，主要功效為止咳祛痰，在眾多治療咳嗽的方劑及中成藥中廣泛使用[1-2].目前，野生浙貝母僅分布于浙江，而人工栽培品種除浙江外，在江蘇、上海及福建等地也有種植[3-4].浙貝母生長(zhǎng)習(xí)性喜濕忌旱、澇，對(duì)土質(zhì)有較嚴(yán)格的要求，且土質(zhì)、水分、溫度和光照等因素均可能對(duì)浙貝母生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，進(jìn)而決定浙貝母的品質(zhì)和產(chǎn)量[5-6].對(duì)此，本研究采集了浙江東陽(yáng)等7個(gè)原產(chǎn)地的浙貝母，并在重慶地區(qū)進(jìn)行栽培，對(duì)其進(jìn)行貝母素甲、貝母素乙、貝母辛及總生物堿等有效成分的含量測(cè)定及差異分析，并基于有效成分含量測(cè)定結(jié)果篩選出適合重慶地區(qū)栽培的浙貝母種源.

1 材料儀器

1.1 材料與試劑

1)實(shí)驗(yàn)所用浙貝母于2014年5月期間采自浙江省東陽(yáng)市千祥鎮(zhèn)東王村等7個(gè)種植基地，所有樣品經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為百合科貝母屬植物浙貝母的鱗莖(見表1).

2)實(shí)驗(yàn)所用試劑包括：貝母素甲對(duì)照品(批號(hào)，B20080)、貝母素乙對(duì)照品(批號(hào)，B20081)、貝母辛對(duì)照品(批號(hào)，B20082)，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，乙腈色譜純(美國(guó)Fiser公司)；甲醇(批號(hào)，M813895)、三氯甲烷(批號(hào)，B139244)，購(gòu)自天津恒興化學(xué)試劑公司，水為娃哈哈牌純凈水，其余試劑均為分析純.

表1樣品來(lái)源

No.采集地經(jīng)緯度海拔/m采集日期S1浙江省東陽(yáng)市千祥鎮(zhèn)東王村120°06′49″/29°01′57″1692014.05.14S2浙江省磐安縣尚湖鎮(zhèn)小坑門村120°38′24″/29°06′58″4862014.05.15S3浙江省磐安縣仁川鎮(zhèn)方山村120°42′55″/28°89′59″5022014.05.14S4浙江省磐安縣新渥鎮(zhèn)古竹村120°23′27″/28°57′02″3502014.05.13S5浙江省磐安縣仁川鎮(zhèn)半坑村120°26′27″/28°53′11″5412014.05.15S6安徽省蕪湖縣花橋鎮(zhèn)苗育村118°37′02″/31°15′13″1 4002014.05.11S7江蘇省通州區(qū)張芝鎮(zhèn)啟橋村121°01′17″/31°56′27″142014.05.08

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：LC-20D型高效液相色譜儀(島津公司)；KH-5205D型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；CP-224C型分析天平(奧豪斯儀器有限公司).

2 方 法

2.1 浙貝母總生物堿的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液制備.

取貝母素甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.4 mg貝母素甲的溶液，制得對(duì)照品溶液.

2.1.2 供試品溶液制備.

取本品干燥粉末(過(guò)六號(hào)篩)約2 g， 精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入濃氨試液4 mL浸泡1 h，精密加入三氯甲烷—甲醇(4∶1)混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，于85 ℃水浴中加熱回流2 h，取出，自然冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò).精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中水浴揮干，殘?jiān)由倭考状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.

分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，水浴揮干，精密加入鄰苯二甲酸氫鉀—?dú)溲趸c緩沖液(pH值5.0)5 mL、顯色劑溶液4 mL，振搖混勻，再精密加入三氯甲烷15 mL，振搖后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，靜置1 h.以三氯甲烷試劑為空白，在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，貝母素甲濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為，A=0.0353C-0.0537(r=0.9994).結(jié)果表明，貝母素甲對(duì)照品在4.0～28.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.1.4 樣品含量測(cè)定.

精密量取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液1.0～3.0 mL，置50 mL錐形瓶中，水浴揮干溶劑，按照“2.3.1”項(xiàng)下，自“精密加入鄰苯二甲酸氫鉀—?dú)溲趸c緩沖液(pH值5.0)5 mL”起，依法測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中貝母素甲的質(zhì)量(mg).本品總生物堿含量以貝母素甲計(jì)算[7]，結(jié)果見表2.

表2 浙貝母原產(chǎn)地及其遷地引種后浙貝母總生物堿含量(mg/g)

注：*為顯著(P<0.05)；**為高度顯著(P<0.01).

2.2 浙貝母生物堿的測(cè)定

2.2.1 色譜條件.

實(shí)驗(yàn)的色譜柱條件為：色譜柱為Durashell C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為A相(乙腈)、B相(0.01 %三乙胺水溶液)；梯度洗脫(0～10 min，30% A，10～15 min，30% A→38% A，15～25 min，38% A→60% A，25～35 min，60% A，35～50 min，60% A→70% A，50～70 min，70% A→90% A)；漂移管溫度57 ℃；載氣流速2.0 L/min；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃.

按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各組分分離度良好，對(duì)照品和供試品的HPLC色譜圖如圖1所示.

1.貝母辛； 2.貝母素甲； 3.貝母素乙

圖1混合對(duì)照品(A)和供試品(B)HPLC圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備.

分別精密稱取貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對(duì)照品適量，溶解于甲醇，制成一定濃度的對(duì)照品溶液，備用.

2.2.3 供試品溶液的制備.

精密吸取“2.1.2"項(xiàng)下的供試品溶液10 mL，置蒸發(fā)皿中水浴揮干溶劑，殘?jiān)蛹状歼m量使其溶解，并轉(zhuǎn)移至2 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.2.4 線性關(guān)系考察.

精密稱取貝母素甲、貝母素乙和貝母辛對(duì)照品適量，溶于甲醇，制成每1 mL分別含貝母素甲0.412 mg、貝母素乙0.304 mg和貝母辛0.452 mg的混合溶液.精密量取此混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算得到貝母素甲、貝母素乙、貝母辛的回歸方程分別為:Y=332 543X-365 852(r=0.9996)、Y=207 718X-186 154(r=0.9998)、Y=178 449X-182 918(r=0.9995)，線性范圍分別為0.103～0.412 μg/μL、0.076～0.304 μg/μL、0.113～0.452 μg/μL.

2.2.5 樣品含量測(cè)定.

取浙貝母原產(chǎn)地及其遷地引種后浙貝母藥材樣品粉末，按“2.2.3"項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計(jì)算各樣品中貝母素甲、貝母素乙、貝母辛的含量，結(jié)果見表3.

表3 浙貝母原產(chǎn)地及其遷地引種后浙貝母生物堿含量(mg/g)

2.3 結(jié)果與分析

1)由浙貝母樣品總生物堿含量測(cè)定結(jié)果及方差分析可知，不同地區(qū)栽培的浙貝母中總生物堿含量存在較大的差異，此結(jié)果與尹尚軍[7]、陳梅梅等[8]的報(bào)道相似.浙江東陽(yáng)(S1)、尚湖小坑門(S2)、仁川方山(S3)、新渥古竹(S4)、安徽花橋(S6)等5地浙貝母經(jīng)遷地引種后，其總生物堿含量顯著上升，其余兩地浙貝母該成分含量引種前后未有較大變化.浙貝母總生物堿含量經(jīng)遷地引種后總體呈上升趨勢(shì)，證明浙貝母引種后，其主要有效成分與引種前相比，保持穩(wěn)定或有所增高，該結(jié)論是浙貝母引種至重慶地區(qū)的重要實(shí)驗(yàn)依據(jù).

2)由浙貝母原產(chǎn)地及其遷地引種后浙貝母樣品生物堿含量測(cè)定結(jié)果可知，各地浙貝母引種后生物堿含量與引種前相比均具有差異.仁川半坑(S5)浙貝母經(jīng)遷地引種后，其貝母素甲和貝母素乙含量分別為0.65%和0.23%，對(duì)比引種前分別升高48.65%和28.71%.安徽花橋(S6)的浙貝母經(jīng)遷地引種后貝母素甲和貝母素乙含量分別為1.47%和0.31%，對(duì)比引種前升高502.37%和39.76%.上述兩種引種后的浙貝母中生物堿含量均符合《中國(guó)藥典》(2015年版一部)浙貝母藥材項(xiàng)下“含量測(cè)定”的限定標(biāo)準(zhǔn)(貝母素甲和貝母素乙的總量不低于0.080%)[1].新渥古竹(S4)地區(qū)浙貝母的生物堿含量降低，其總生物堿含量卻在上升，這可能與浙貝母中其他生物堿類成分的含量有關(guān)，但具體的生物堿種類還有待進(jìn)一步研究.安徽花橋(S6)浙貝母引種后，總生物堿含量為7個(gè)地區(qū)最高，且高于浙貝母道地產(chǎn)區(qū)浙江，其原因可能與其當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、土質(zhì)和海拔有關(guān)[9].但對(duì)于總生物堿與單類生物堿成分含量變化的不統(tǒng)一，其內(nèi)在原因還有待研究.

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)浙貝母原產(chǎn)地及其遷地引種后的含量分析可知，浙貝母經(jīng)遷地引種至重慶地區(qū)后，其指標(biāo)性成分(生物堿類成分)具有較大的差異，其中仁川半坑(S5)、安徽花橋(S6)兩地的浙貝母經(jīng)遷地栽培后該成分顯著上升，可引種至重慶地區(qū)栽培.本研究結(jié)論為浙貝母在重慶地區(qū)的引種栽培提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).