張?zhí)焘?綜述 周雙白 李青峰 審校

【提要】 干細(xì)胞具有促進(jìn)組織修復(fù)與再生的作用，蘊(yùn)藏著廣泛的臨床應(yīng)用前景。低溫凍存是實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞長(zhǎng)期保存的常用方法。在低溫保存過(guò)程中，有效的冷凍保護(hù)劑（CPA）對(duì)于防止細(xì)胞低溫?fù)p傷和保持細(xì)胞活力至關(guān)重要。本文將對(duì)干細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞等，其在特定的條件下能分化成體內(nèi)多種類型的細(xì)胞[1-3]。干細(xì)胞具有多種用途和功能，可用于體外研究組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育、建立疾病模型、藥物篩選，也可用于疾病治療，如組織修復(fù)與再生等[4-5]。干細(xì)胞的長(zhǎng)期保存需要進(jìn)行冷凍保存，但冷凍保存的過(guò)程對(duì)細(xì)胞具有一定的損傷。冷凍保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞免受低溫凍存中的冷凍損傷，能更好地保存細(xì)胞的生物性能。本文將對(duì)近年來(lái)干細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 冷凍損傷的機(jī)制

組織和細(xì)胞雖可在-196 ℃低溫下長(zhǎng)期保存，但易在降溫和復(fù)溫過(guò)程中受溶液凍結(jié)、融化以及溶液滲透壓變化等因素的作用而受到損害。冷凍損傷通常發(fā)生在0 ℃到-60 ℃的溫度范圍內(nèi)。對(duì)于引起冷凍損傷的機(jī)制一直是低溫生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)，目前存在多種假說(shuō)，比如電解質(zhì)失衡假說(shuō)、兩要素假說(shuō)、生物膜損傷假說(shuō)以及結(jié)構(gòu)假說(shuō)等[6]。其中，Mazur 等[7]提出了“兩要素假說(shuō)”，認(rèn)為引起細(xì)胞冷凍損傷的因素主要有以下兩種。

1.1 細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成（Intracellular Ice Formation，IIF）

高速率冷卻狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)水分子被快速凍結(jié)后，細(xì)胞不再進(jìn)一步脫水，使其內(nèi)部的水分子不能玻璃化，進(jìn)而提高了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成程度。冰晶會(huì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的多種生物膜產(chǎn)生機(jī)械或者生物化學(xué)應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷。研究表明，大的內(nèi)部冰晶的存在是致命的[8]。細(xì)胞內(nèi)冰晶是否對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷取決于冰晶的大小、位置、數(shù)量以及復(fù)溫條件[9-10]。復(fù)溫解凍時(shí)，緩慢升溫將使細(xì)胞內(nèi)冰晶玻璃化之后的水形成結(jié)晶或重結(jié)晶，這將會(huì)對(duì)細(xì)胞造成致死性損傷。

1.2 溶液效應(yīng)損傷

冰晶會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外溶液性質(zhì)的改變，細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于改變的內(nèi)外溶液中將會(huì)產(chǎn)生低溫?fù)p傷，這些改變或溶液效應(yīng)包括溶質(zhì)的濃度、酸堿平衡、細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓的改變以及嚴(yán)重脫水后溶質(zhì)濃縮沉淀[11]。

2 冷凍保護(hù)劑作用機(jī)制

冷凍保護(hù)劑可以同溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過(guò)程，使溶液的黏性增加從而減少冰晶的形成[12]，同時(shí)冷凍保護(hù)劑可通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷。研究表明，細(xì)胞懸液中加入冷凍保護(hù)劑可保護(hù)細(xì)胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護(hù)劑根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜通常分為兩大類型：滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑[13]。滲透性冷凍保護(hù)劑多為小分子中性物質(zhì)，其作用為弱化水結(jié)晶過(guò)程以及減少對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，主要包括甘油、二甲基亞砜（DMSO）、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性保護(hù)劑多為大分子物質(zhì)，通過(guò)降低溶質(zhì)濃度減少低溫凍存對(duì)細(xì)胞的傷害，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等。

3 經(jīng)典的冷凍保護(hù)劑及其存在的問(wèn)題

經(jīng)典的冷凍保護(hù)劑為10%DMSO，可加入10%～90%FBS（提供營(yíng)養(yǎng)），因成本低廉、效果優(yōu)良、易操作，而被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞的冷凍保存[14]。然而，DMSO 作為經(jīng)典的冷凍保護(hù)劑雖可降低保存液的冰點(diǎn)并減少胞內(nèi)冰的形成，但是一系列的研究表明，DMSO 可能會(huì)改變?nèi)旧w的穩(wěn)定性，并導(dǎo)致細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的變化，反過(guò)來(lái)導(dǎo)致腫瘤的形成[15-16]；并且，DMSO 自身也具有一定的毒性[17]。DMSO 對(duì)組織和細(xì)胞的毒性取決于暴露時(shí)間、溫度和濃度，另外FBS 為異種動(dòng)物組分，有引入人朊病毒而造成人畜共患病及導(dǎo)致免疫反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)[18]；同時(shí)，血清的組分、來(lái)源和生產(chǎn)批次，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)有不良或不一致的影響。

4 新型冷凍保護(hù)劑

無(wú)毒性、易洗脫以及無(wú)異種抗原是新型冷凍劑選用的原則。根據(jù)這一原則，近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外最新研究報(bào)道了幾類新型冷凍保護(hù)劑。

4.1 無(wú)異種蛋白的冷凍保護(hù)劑

無(wú)異種蛋白的冷凍保護(hù)劑分為兩類。一類為人白蛋白冷凍保護(hù)劑，Park 等[19]使用人白蛋白替代了FBS，即生理鹽水+10%DMSO+9%人體白蛋白（HSA）凍存hADSC，凍存1 周后復(fù)蘇，與經(jīng)典冷凍保護(hù)劑對(duì)比，細(xì)胞存活率和細(xì)胞表型均無(wú)顯著性差異，集落形成能力（CFU）、成脂、成骨和成軟骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果均好于經(jīng)典冷凍保護(hù)劑。該冷凍保護(hù)劑不含有動(dòng)物源性血清，不會(huì)引入外源蛋白，降低了動(dòng)物病原污染的可能性。另一類為人血小板裂解物（PL）冷凍保護(hù)劑。Wang 等[20]通過(guò)使用97%人類血小板裂解物+3%DMSO、95%FBS+5%DMSO 以及90%FBS+10%DMSO 三組凍存液分別凍存hADSC，復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)三組細(xì)胞的存活率均高于80%；在無(wú)DMSO 冷凍保護(hù)劑存在的條件下，經(jīng)過(guò)自身PL 處理過(guò)的hADSC 比FBS 處理過(guò)的hADSC 擁有更高的存活率、更好的成骨分化能力以及更短的倍增時(shí)間。這種冷凍保護(hù)劑無(wú)任何動(dòng)物成分和異源性成分，可減少DMSO 的濃度，同時(shí)可釋放多種生長(zhǎng)因子促進(jìn)hADSC 體外增殖，但對(duì)于PL 促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制及其在其他干細(xì)胞中的凍存效果還需進(jìn)一步了解[21]。

4.2 海藻糖

海藻糖無(wú)毒，易洗脫，在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下，能在細(xì)胞表面形成獨(dú)特的保護(hù)膜，具有較高的玻璃轉(zhuǎn)變溫度[22-23]，可防止細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成。婁琳等[24]分別使用不同濃度的海藻糖凍存造血干細(xì)胞，凍存后通過(guò)錐蟲藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率和CD34-PE/CD45-FITC 雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34+細(xì)胞回收率（凍存后值/凍存前值×100%）。實(shí)驗(yàn)證明，海藻糖對(duì)于短期內(nèi)低溫凍存的造血干細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其中0.5 M 的海藻糖凍存效果最好。Martinetti 等[9]分別使用不同濃度的海藻糖和經(jīng)典冷凍保護(hù)劑凍存人外周血干細(xì)胞，復(fù)蘇后檢測(cè)細(xì)胞活性和增殖能力。結(jié)果顯示，1.0 M 海藻糖凍存效果好于經(jīng)典的冷凍保護(hù)劑。在此基礎(chǔ)上，Ntai 等[25]分別使用不同濃度的滲透性冷凍劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑相結(jié)合來(lái)凍存人的多能干細(xì)胞，凍存1 周后復(fù)蘇，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞活性、染色體的穩(wěn)定性以及基因毒性等檢測(cè)，證實(shí)0.5 M 海藻糖結(jié)合10%甘油凍存多能干細(xì)胞的效果好于單獨(dú)使用海藻糖。

4.3 含0.5%瓊脂糖液體彈珠（Liquid Marbles，LM）

LM 是被高疏水性顆粒包裹形成的不潤(rùn)濕的液滴，可穩(wěn)定地黏附于固體及液體表面，是一種凍存細(xì)胞的新型材料[26]。有研究使用含有0.5%瓊脂糖和50% FBS 的LM 凍存鼠的3T3 細(xì)胞和L929 成纖維細(xì)胞，復(fù)蘇后發(fā)現(xiàn)，不管是在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率還是細(xì)胞增殖方面，均好于傳統(tǒng)凍存劑，與新鮮細(xì)胞無(wú)明顯差異[27－28]。但是，LM 中含有FBS 成分，對(duì)于如何去除FBS 還有待于進(jìn)一步研究。

4.4 羥乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES）

HES 是一種非滲透性保護(hù)劑，不僅可以在冷凍過(guò)程中減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，還可降低DMSO 的濃度，減少對(duì)細(xì)胞的損傷。魯瑞周等[29]使用5%DMSO+HES 冷凍保護(hù)劑凍存臍帶造血干細(xì)胞，與10%DMSO 冷凍保護(hù)劑凍存過(guò)的細(xì)胞比較，發(fā)現(xiàn)兩者雖然在細(xì)胞存活率方面無(wú)顯著差異，但前者的粒-巨噬細(xì)胞集落回收率（CFU-GM）明顯更高，且存在顯著性差異。李雯瑛等[30]使用DMSO+HES 聯(lián)合冷凍保護(hù)劑凍存外周造血干細(xì)胞，凍存2 周后復(fù)蘇，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的存活率以及CFUGM 均達(dá)90%。

4.5 海藻酸鈉聯(lián)合丙二醇（PROH）

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取碘和甘露醇之后的副產(chǎn)物，其水溶液可在溫和的條件下快速形成凝膠，當(dāng)有Ca2+等陽(yáng)離子存在時(shí)，可發(fā)生離子交換，形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而形成水凝劑，包裹細(xì)胞，在凍存時(shí)可以抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成[31]。丙二醇其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，毒性小且具有較低的冰點(diǎn)，常用作冷凍保護(hù)劑。Huang 等[32]首先使用海藻酸鈉包裹細(xì)胞，然后加入丙二醇等作為冷凍保護(hù)劑凍存mESC 和hADSC，凍存后發(fā)現(xiàn)不管在細(xì)胞活性、增殖能力還是功能學(xué)上，均與新鮮細(xì)胞無(wú)顯著性差異，且可以很好地促進(jìn)細(xì)胞的玻璃化凍存以及避免細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程中反玻璃化現(xiàn)象的出現(xiàn)。

5 總結(jié)與展望

干細(xì)胞具有良好的臨床應(yīng)用前景，其長(zhǎng)期安全穩(wěn)定保存是一重要問(wèn)題。冷凍保護(hù)劑可有效降低細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞凍存后的活性。經(jīng)典冷凍保護(hù)劑含有DMSO，并不適合臨床使用，安全無(wú)毒、無(wú)異種抗原的冷凍保護(hù)劑是目前研究的主要方向，新型冷凍保護(hù)劑的開發(fā)對(duì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用具有重要意義。