陳 明，王 恒，趙鴻賓，余躍生，段 萍，范 芳

1黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校；2黔南州藥品檢驗(yàn)所，都勻558000； 3遵義醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遵義 563000

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌不足及胰島素抵抗而引起，以慢性高血糖為特征，常伴有全身代謝紊亂的一種多病因的代謝疾病。其中1型糖尿病是由于胰島β細(xì)胞受到細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性破壞，導(dǎo)致胰島素分泌絕對(duì)不足引起的代謝紊亂[1]。烏蕨(Stenolomechusanum(L)Ching,SLC)系鱗始蕨科烏蕨屬植物，為多年生草本，其味微苦，性寒，具有清熱解毒、利濕、止血的功效，廣泛分布于我國(guó)許多省份和地區(qū)，民間長(zhǎng)期用其治療外傷感染[2]?，F(xiàn)代研究表明SLC含有黃酮、酚類、揮發(fā)油、甾體和多糖等成分，其提取物或單體化合物具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化、抗炎、保肝、止血、解毒等作用[3,4]。課題組在前期研究了SLC對(duì)2型糖尿病小鼠的降血糖作用[5]，本研究旨在進(jìn)一步觀察SLC提取物對(duì)鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)致1型糖尿病模型大鼠空腹血糖的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)7～8周齡SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黔)[2012-0001]。飼養(yǎng)于室溫18～22 ℃、相對(duì)濕度60%～65%、光照周期每天12 h的環(huán)境中。適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。

1.2 藥品與試劑

SLC原植物采摘于貴州省都勻市馬鞍山林區(qū)，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校中藥教研室魏學(xué)軍教授鑒定為鱗始蕨科SLC屬植物。鏈脲佐菌素，批號(hào)：20150625；胰島素(insulin,INS)，批號(hào)：20150722，均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(代購(gòu)于Sigam公司，美國(guó))。葡萄糖激酶(glucokinase,GCK)、醛糖還原酶(aldose Reductase,AR)、血糖測(cè)試盒(批號(hào)：201705)，武漢基因美生物科技有限公司。檸檬酸、檸檬酸三鈉(20150452)，天津市津宏化工有限公司。

1.3 儀器和設(shè)備

AG-696型血糖測(cè)試儀，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；Multiskan MS型酶標(biāo)儀， Lab-systems公司,芬蘭；TDL-4ZB型臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器廠；Agilent Cary 100型分光光度計(jì)，安捷倫科技有限公司,美國(guó)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SLC提取物的制備

取干燥的SLC藥材(地上部分)粉碎過(guò)篩，稱取1 000 g，用15倍量65%乙醇，80 ℃水浴回流提取三次，1 h/次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加石油醚萃取5次，將母液減壓蒸發(fā)除去石油醚，然后加入等體積乙酸乙酯，萃取4～6次，合并乙酸乙酯萃取液，將其減壓濃縮，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取物，減壓干燥；稱取干燥的乙酸乙酯萃取物適量，加少量水溶解，加適量吐溫80，配制成相應(yīng)濃度，供實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 STZ緩沖液的配制及誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型的制備[6]

2.2.1 STZ緩沖液的配制

將STZ冰浴、避光溶解于0.1 mol/L的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液中(pH4.5)，制成濃度為10 mg/mL的STZ液。

2.2.2 1型糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為兩組，空白對(duì)照組10只，模型復(fù)制組50只；常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食攝水，禁食不禁水過(guò)夜(約16 h)。正常組按6 mL/kg劑量腹腔注射檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液。模型復(fù)制組大鼠按60 mg/kg劑量腹腔注射STZ，注射72 h后，將全部大鼠禁食過(guò)夜，尾靜脈采血，測(cè)定空腹血糖(fasting Blood glucose,FBG)值。FBG值高于16.7 mmol/L，且出現(xiàn)“三多一少”癥狀者為模型復(fù)制成功。模型復(fù)制組有34只大鼠符合1型糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 分組及給藥

空白對(duì)照組(CG)10只。將34只模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為1型糖尿病模型組(IG)12只，用生理鹽水灌胃；SLC低劑量組(LG)11只(30 mg/kg)及SLC高劑量組(HG)11只(60 mg/kg)用相應(yīng)劑量SLC醇提取物灌胃。以上各組灌胃體積為20 mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)28天。

2.4 血清制備及相關(guān)指標(biāo)分析

各組大鼠灌胃28天后，尾靜脈采血測(cè)血糖；股動(dòng)脈取血，離心(3 000 rpm)10 min 取血清，根據(jù)待測(cè)生化指標(biāo)分析需要分裝，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。測(cè)定各組血清中INS、GCK及AR含量，計(jì)算降血糖率(Glucose lowering rate,GLR)=(模型組血糖均值-受試藥物組血糖均值)/模型組血糖均值×100%[7]。

2.5 大鼠胰腺病理形態(tài)學(xué)觀察

取血后處死大鼠，立即取胰島組織，以中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 SLC提取物對(duì)大鼠體重的影響

造模前各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P>0.05)。灌胃28天后，1型糖尿病模型組大鼠體重呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，空白對(duì)照組及SLC提取物高劑量組大鼠體重顯著上升(P<0.05)；與1型糖尿病模型組相比，SLC提取物高、低劑量組大鼠體重增加(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 SLC醇提取物對(duì)大鼠體重的影響 (n=44,± s)Table 1 Effects of SLC alcohol extract on body weight in rats (n=44,± s)

注：與同組灌胃前比較，*P<0.05，與1型糖尿病模型組比較﹟P<0.05
Note:*P<0.05,compared with the same group before gavage,#P<0.05,compared with the type 1 diabetes model group.

3.2 SLC提取物對(duì)大鼠空腹血糖及降糖率的影響

模型復(fù)制后空白對(duì)照組FBG低于16.7 mmol/L，其余各組血糖均高于16.7 mmol/L，且大鼠出現(xiàn)三多一少癥狀，表明模型復(fù)制成功。灌胃前，空白對(duì)照組大鼠FBG均低于其他各組(P<0.05)，其他各組間FBG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌胃28天后，與空白對(duì)照組相比，其余各大鼠FBG顯著上升(P<0.05)。與1型糖尿病模型組相比，SLC提取物高、低劑量組FBG顯著下降(P<0.05)；但SLC提取物高、低劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 SLC提取物對(duì)大鼠FBG及GLR的影響Table 2 Effects of SLC alcohol extract on FBG and GLR in rats

注：灌胃前，與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；灌胃后與1型糖尿病模型組比較，﹟P<0.05。
Note:*P<0.05,before treatment,compared with the control group,;#P<0.05,after treatment,compared with type 1diabetes model group.

3.3 SLC提取物對(duì)大鼠胰島素的影響

灌胃28天后，與空白對(duì)照組相比，各組大鼠血清INS水平均下降(P<0.05)；與1型糖尿病模型組比較，SLC高、低劑量組INS水平顯著增加(P<0.05)，SLC高、低劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表3)。

表3 SLC提取物對(duì)大鼠INS水平的影響Table 3 Effects of SLC alcohol extract on INS in rats

注：*P<0.05,與空白對(duì)照組比較；﹟P<0.05,與1型糖尿病模型組比較。
Note:*P<0.05,compared with the control group;#P<0.05,compared with the type 1diabetes model group.

3.4 SLC提取物對(duì)大鼠血清GCK、AR的影響

與空白對(duì)照組比較，各組大鼠血清GCK含量顯著下降(P<0.05)，與1型糖尿病模型組比較，SLC高、低劑量組GCK均出現(xiàn)了顯著增加(P<0.05)；與1型糖尿病模型組比較，SLC高、低劑量組AR含量顯著降低(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 SLC提取物對(duì)大鼠GCK、AR的影響Table 4 Effects of SLC alcohol extract onGCK、AR in rats

注：*P<0.05,與空白對(duì)照組比較；﹟P<0.05,與1型糖尿病模型組比較。
Note:*P<0.05,compared with the control group;#P<0.05,compared with the type I diabetes model group.

3.5 SLC提取物對(duì)大鼠胰島形態(tài)學(xué)的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組胰島分布正常，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整、分布規(guī)則，胰島形態(tài)及外分泌腺無(wú)明顯病理改變(Fig.1A)。1糖尿病模型組胰島萎縮，胰島數(shù)目明顯減少，胰島部分細(xì)胞空泡變性，胰島內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig.1B)。SLC提取物高劑量組較1糖尿病模型組，胰島萎縮不同程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，胰島數(shù)目增加(Fig.1D)。

圖1 SLC提取物對(duì)大鼠胰島形態(tài)學(xué)的影響Fig.1 Effects of SLC alcohol extract on islet morphology in rats注：A.空白對(duì)照組 B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組。Note:A.Control group B.type I diabetes model group;C.Low dose group;D.High dose group.

4 結(jié)論

本研究采用鏈脲佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)法復(fù)制1型糖尿病動(dòng)物模型，造模后大鼠FBG值高于16.7 mmol/L，且出現(xiàn)“三多一少”癥狀者為模型復(fù)制成功。

GCK是己糖激酶同工酶的一種，存在于胰腺和肝臟中，是糖代謝的重要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病個(gè)體中普遍存在GCK 活性的降低[8]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GCK對(duì)糖代謝有顯著調(diào)節(jié)作用，GCK活性微小的改變即可導(dǎo)致糖代謝的顯著變化，因此認(rèn)為GCK是具有前景的糖尿病治療藥物新靶點(diǎn)。AR是多元醇通路中重要的限速酶，持續(xù)高血糖刺激下，細(xì)胞內(nèi)多元醇代謝通路被激活，葡萄糖在AR的催化下還原為滲透性強(qiáng)的山梨醇，后者在山梨醇脫氫酶(SDH)作用下轉(zhuǎn)化成果糖。腎組織AR活性的增強(qiáng)，機(jī)體抗氧化能力低下與糖尿病腎損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[9]，GCK是INS分泌的葡萄糖感受器，可影響INS的分泌，具有協(xié)同INS調(diào)控糖代謝的能力[10]。

本研究用SLC醇提取物對(duì)1型糖尿病模型大鼠進(jìn)行降血糖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與模型組比較，SLC提取物低劑量組在給藥28天后大鼠體重?zé)o明顯變化，高劑量組給藥28天后體重顯著增加；SLC提取物可顯著降低1型糖尿病大鼠FBG水平，同時(shí)顯著升高1型糖尿病大鼠的血清INS濃度。SLC提取物高劑量組、低劑量組的GLR分別達(dá)到45.90%、40.30%。提示SLC提取物能有效緩解糖尿病大鼠消瘦的狀況，對(duì)大鼠糖尿病的癥狀有一定緩解作用。為進(jìn)一步了解SLC提取物緩解大鼠糖尿病癥狀的可能機(jī)制，本研究觀察了SLC提取物對(duì)糖尿病大鼠胰島形態(tài)學(xué)及血清GCK、AR含量的影響。結(jié)果顯示，在灌胃28天后不同劑量SLC提取物對(duì)大鼠受損的胰島結(jié)構(gòu)均有修復(fù)作用，主要體現(xiàn)為：胰島及外分泌腺萎縮程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，胰島數(shù)目增加。其中，高劑量組修復(fù)作用優(yōu)于低劑量組。血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，SLC提取物能夠顯著增高糖尿病大鼠血清GCK含量、顯著降低AR。

綜上所述，SLC提取物對(duì)STZ所致1型糖尿病大鼠有降血糖作用，可降低1型糖尿病大鼠FBG，增加體重，修復(fù)受損的胰島結(jié)構(gòu)。其降糖作用可能與升高糖尿病大鼠血清GCK含量和降低AR含量，改善模型組大鼠胰島損傷，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌INS有關(guān)。SLC對(duì)糖尿病大鼠的降血糖作用及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。