楊 旭 謝 盈

(1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2. 陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000)

茶渣是茶葉經(jīng)過加工利用后或成品茶經(jīng)沖泡飲用后的剩余殘渣。中國有眾多茶飲料、茶多酚、速溶茶生產(chǎn)廠家，每年這些廠家產(chǎn)生的茶葉濕廢渣達(dá)幾十萬噸之多[1]。依托于中國第二大富硒區(qū)安康獨特的地理地質(zhì)環(huán)境，茶葉作為當(dāng)?shù)孛麅?yōu)資源具備天然富硒特色[2-3]。富硒茶中硒的主要賦存形式為硒蛋白，占總硒含量的60.12%，但茶葉中的硒蛋白多為堿溶性，經(jīng)水浸泡無法溶出而留于茶渣中，占茶渣總量的23.81%之高[4]18。已報道的文獻(xiàn)[4]42-48 [5-6][7]11-17多是對普通茶渣中蛋白的提取及功能性質(zhì)分析，以及富硒茶葉、茶粉中硒蛋白的提取工藝優(yōu)化，而關(guān)于富硒茶茶渣中硒蛋白的分離純化、性質(zhì)研究卻未見報道，相關(guān)基礎(chǔ)研究的缺乏制約了富硒茶渣資源的開發(fā)利用。

本試驗擬以堿提法對紫陽富硒茶沖泡后剩余茶渣中的硒蛋白進(jìn)行提取，利用脫色、沉淀等方法初步分離純化硒蛋白，并對制備得到的純化硒蛋白中硒有機(jī)化程度、氨基酸組成、功能特性及抗氧化活性進(jìn)行了分析。以期明確硒蛋白的分離純化工藝和相關(guān)性質(zhì)，為茶渣作為茶蛋白的優(yōu)質(zhì)資源和硒的富集資源應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域提供研究依據(jù)，從而尋求富硒茶及其產(chǎn)品研發(fā)的新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富硒綠茶：安康紫陽向陽茶廠；

硝酸、鹽酸：優(yōu)級純，成都科龍化工試劑廠；

牛血清白蛋白(BSA)：上海江萊生物科技有限公司；

1, 1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2, 2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)：日本TCI公司；

XDA-7大孔吸附樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；

硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 000 μg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

低速離心機(jī)：LD4-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

恒溫振動水浴鍋：SHA-C型，常州國華電器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

原子熒光光度計：AFS-930型，北京吉天儀器有限公司；

小型控溫加熱板：ECH-Ⅱ型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

溫壓雙控微波消解儀：MDS-6型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：SCIENTZ-50N型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

全自動氨基酸分析儀：L-8900型，日立高新技術(shù)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 富硒綠茶原料按浸泡溫度85 ℃、浸泡時間30 min、沖泡2次、料液比110∶1 (mL/g)的方式[8]進(jìn)行沖泡后，剩余茶渣置于恒溫干燥箱中，50 ℃下干燥至恒重，粉碎過60目篩備用。

1.2.2 茶渣硒蛋白的提取 稱取上述茶渣樣品1 g，根據(jù)預(yù)試驗所得的優(yōu)化提取工藝，用0.075 mol/L NaOH溶液，按1∶60 (g/mL)的料液比于54.2 ℃下水浴振蕩提取4 h，抽濾后浸提液在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，冷凍干燥。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[9]，以BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同樣的反應(yīng)條件下，取1 mL浸提液進(jìn)行測定。

1.2.4 茶渣硒蛋白的脫色工藝

(1) 脫色效果的指標(biāo)測定：根據(jù)吳芳[10]的脫色效果評價方法略作修改，采用紫外分光光度計在190～1 100 nm波長內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收峰對應(yīng)波長為216 nm，并在此波長下測定脫色前后浸提液的吸光度，按式(1)、(2)計算脫色率和蛋白質(zhì)損失率。

DR=[(A1-A2)/A1]×100%，

(1)

式中：

DR——脫色率，%；

A1——脫色前浸提液吸光度；

A2——脫色后浸提液吸光度。

LR=[(P1-P2)/P1]×100%，

(2)

式中：

LR——蛋白質(zhì)損失率，%；

P1——脫色前浸提液中的蛋白質(zhì)含量，μg/mL；

P2——脫色后浸提液中的蛋白質(zhì)含量，μg/mL。

(2) 活性炭脫色法：分別按5∶100，10∶100，15∶100，20∶100，25∶100，30∶100 (g/mL)的比例向浸提液中添加處理活化的活性炭，于90 ℃恒溫水浴下脫色1 h，抽濾后收集脫色液，測定脫色率和蛋白質(zhì)損失率。

(3) 雙氧水脫色法：分別按0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL/100 mL 的比例向浸提液中添加體積分?jǐn)?shù)為30%的雙氧水溶液，室溫下放置于磁力攪拌器上攪拌反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)速為200 r/min，而后靜置30 min，測定脫色率和蛋白質(zhì)損失率，選取最適的雙氧水用量。

(4) XDA-7大孔樹脂脫色法：根據(jù)王丹[11]12的大孔樹脂脫色法修改如下，預(yù)處理后的XDA-7大孔樹脂采用濕法裝柱(Φ2.5 cm×40 cm)，取蛋白質(zhì)濃度6.69 mg/mL的茶渣硒蛋白浸提液100 mL進(jìn)樣，速度控制為1 BV/h。然后用質(zhì)量濃度為2%的NaOH溶液洗脫至280 nm下無蛋白質(zhì)特征吸收，收集洗脫液并濃縮至100 mL，測定脫色率和蛋白質(zhì)損失率。

按確定的雙氧水用量向浸提液中添加后，分別于20，30，40，50，60 ℃下攪拌反應(yīng)30 min后，靜置30 min，測定脫色率和蛋白質(zhì)損失率，選取最適的反應(yīng)溫度。

1.2.5 茶渣硒蛋白的沉淀工藝 根據(jù)陸晨[7]15的等電點沉淀法修改如下：向 5 支 30 mL 離心管中各加入20 mL 浸提液，分別調(diào)節(jié)pH至2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，室溫下靜置30 min，并于4 000 r/min離心30 min，棄去上清液后干燥稱重，從而確定最適沉淀點。

1.2.6 茶渣硒蛋白性質(zhì)

(1) 硒有機(jī)化程度：硒元素含量測定參照文獻(xiàn)[12]。準(zhǔn)確稱取茶渣硒蛋白樣品2 g，測定其總硒含量后，添加濃鹽酸與水按體積比1∶1混合得到的鹽酸溶液20 mL，超聲波功率250 W下輔助浸提30 min，再于沸水浴中浸提30 min，冷卻后經(jīng)脫脂棉過濾，測定濾液中無機(jī)硒含量，并利用減差法[13]按式(3)計算硒有機(jī)化程度。

ROSe=[(TSe-ISe)/TSe]×100%，

(3)

式中：

ROSe——硒有機(jī)化程度，%；

TSe——總硒含量，μg/g；

ISe——無機(jī)硒含量，μg/g。

(2) 氨基酸組成測定：按GB 5009.124—2016執(zhí)行。

(3) 溶解性：參照文獻(xiàn)[14]。

(4) 乳化性和乳化穩(wěn)定性：參照文獻(xiàn)[7]17，配制1 mg/mL 的茶渣硒蛋白液，并調(diào)節(jié)pH至7.0進(jìn)行測定。

(5) 起泡性和泡沫穩(wěn)定性：參照文獻(xiàn)[7]17-18，配制1 mg/mL 的茶渣硒蛋白液，并調(diào)節(jié)pH至7.0進(jìn)行測定。

(6) DPPH自由基清除活性：參照文獻(xiàn)[15]。

(7) ABTS自由基清除活性：參照文獻(xiàn)[16]。

(8) 羥基自由基清除活性的測定：采用Fenton-水楊酸反應(yīng)體系[15]，以紫外分光光度法對其活性進(jìn)行評價。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，每次樣品的測定均重復(fù)3次。采用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析(P<0.05即為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶渣硒蛋白的脫色工藝確定

2.1.1 活性炭脫色 圖1為茶渣硒蛋白浸提液脫色率和蛋白質(zhì)損失率隨活性炭添加量的變化曲線。在受試添加量范圍內(nèi)，脫色率明顯低于蛋白質(zhì)損失率，且兩者均隨添加量的增加而提高。當(dāng)添加量達(dá)到25 g/100 mL時，脫色率和蛋白質(zhì)損失率分別為(47.74±0.40)%和(52.16±0.78)%，而后趨于穩(wěn)定。這可能是浸提液中的呈色物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，被活性炭共同吸附導(dǎo)致。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effect of activated carbon dosage on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

2.1.2 雙氧水脫色 雙氧水添加量對茶渣硒蛋白浸提液脫色率和蛋白質(zhì)損失率的影響如圖2所示。脫色率隨添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)添加量為4.0 mL/100 mL 時，脫色率達(dá)到最高(74.07±0.79)%。蛋白質(zhì)損失率則隨添加量的增加而升高，在4.0～5.0 mL/100 mL 時趨于穩(wěn)定。因此，雙氧水脫色的最適添加量為4.0 mL/100 mL。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effect of hydrogen peroxide dosage on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

圖3表明雙氧水脫色溫度對脫色效果指標(biāo)的影響。從圖3可以看出，脫色率和蛋白質(zhì)損失率均先隨反應(yīng)溫度的升高而增大，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時，脫色率達(dá)到最高為(93.78±0.84)%，此時蛋白質(zhì)損失率為(44.60±0.66)%。隨后，反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，導(dǎo)致雙氧水部分分解，脫色率降低，蛋白質(zhì)損失率則持續(xù)增加。因此，確定最適的反應(yīng)溫度為50 ℃。

不同字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effect of hydrogen peroxide decolorization temperature on decolorization rate and protein loss rate of selenium-protein extracts from tea residue

2.1.3 3種方法的脫色效果比較 在確定的活性炭、雙氧水脫色工藝基礎(chǔ)上，對茶渣硒蛋白浸提液脫色，大孔樹脂脫色則按1.2.4(3)所述方法進(jìn)行。3種方法的脫色效果如表1所示。

表1 3種方法對茶渣硒蛋白浸提液的脫色效果?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3種脫色方法中，雙氧水脫色法的脫色率明顯高于活性炭和XDA-7大孔樹脂脫色法，而蛋白質(zhì)損失率則位于兩者之間。活性炭和XDA-7大孔樹脂脫色法對茶渣硒蛋白提取液的脫色效果不理想，表明其中的呈色物質(zhì)并非以游離狀態(tài)存在，而是與蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合，造成脫色困難，且蛋白質(zhì)損失率較高[11]29-30。雙氧水的強(qiáng)氧化作用使呈色物質(zhì)氧化分解，形成低分子物質(zhì)，而使脫色效果明顯。因此，選擇雙氧水脫色法對茶渣硒蛋白進(jìn)行脫色。

2.2 茶渣硒蛋白的沉淀工藝確定

表2為不同pH下茶渣硒蛋白沉淀量和沉淀率的測定結(jié)果。隨著pH值的增加，沉淀量和沉淀率的變化趨勢一致。當(dāng)pH 3.5時，茶渣硒蛋白沉淀量最大，為(26.7±0.37) mg，此時沉淀率為(61.33±0.86)%，說明pH 3.5是茶渣硒蛋白的最適沉淀點。

表2茶渣硒蛋白的最適沉淀點結(jié)果?

Table 2 Results of optimal precipitation point of selenium-protein from tea residue

pH沉淀量/mg沉淀率/%2.015.9±0.18g36.60±0.41g2.519.3±0.31e44.42±0.71e3.022.5±0.43c51.77±0.99c3.526.7±0.37a61.33±0.86a4.023.5±0.36b54.15±0.82b4.520.4±0.45d46.90±1.04d5.017.2±0.39f39.51±0.90f

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 茶渣硒蛋白的性質(zhì)

2.3.1 硒有機(jī)化程度 根據(jù)DB61/T 556—2012 富硒食品及相關(guān)產(chǎn)品硒含量標(biāo)準(zhǔn)中富硒茶葉、代用茶及含茶制品硒含量為0.15～5.00 mg/kg，確定本研究選用的茶葉原料達(dá)到富硒標(biāo)準(zhǔn)。從表3中可知，茶渣硒蛋白中硒的含量占總硒的22.41%，表明了茶渣作為補(bǔ)硒資源的再利用價值。富硒茶原料和茶渣硒蛋白的硒有機(jī)化程度分別達(dá)到79.47%和79.37%，說明確定的脫色、沉淀工藝未對硒的賦存形態(tài)產(chǎn)生影響，且兩者作為膳食補(bǔ)硒源，具有毒性小，硒的吸收率和生物利用率高等特點[17]。

表3 茶渣硒蛋白中硒有機(jī)化程度

2.3.2 氨基酸組成 茶渣硒蛋白的氨基酸組成及含量測定結(jié)果如表4所示。測定所含有的16種氨基酸中，包括7種必需氨基酸；必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)、必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)分別為73.88%和42.49%；谷氨酸的含量最高，占總氨基酸的13.01%，其次是天門冬氨酸和亮氨酸，分別為10.47%和10.00%，而蛋氨酸含量最低，為0.82%。從氨基酸的化學(xué)性質(zhì)分類來看，疏水性氨基酸含量達(dá)46.04%，表明茶渣硒蛋白具有高疏水性；其他分類的含量變化為：酸性>堿性>不帶電極性。依據(jù)FAO/WHO氨基酸參考模式[18]分析，除蛋氨酸+胱氨酸低于推薦值，蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、亮氨酸均高于參考標(biāo)準(zhǔn)，具有較高的營養(yǎng)價值。

2.3.3 功能特性 圖4為茶渣硒蛋白在不同pH值下的溶解性測定結(jié)果。在pH 4時，氮溶解性指數(shù)最低，此后隨pH的升高而增加，與茶渣硒蛋白的堿溶性一致。受試pH范圍內(nèi)，氮溶解性指數(shù)為(28.35±0.85)%～(52.99±1.59)%，與茶渣硒蛋白較高的疏水性氨基酸含量有關(guān)。因此，茶渣硒蛋白在食品加工中的應(yīng)用，可通過改性的方式提高溶解度來實現(xiàn)。

表4 茶渣硒蛋白的氨基酸組成?

? a. 疏水性氨基酸；b. 堿性氨基酸；c. 酸性氨基酸；d. 不帶電極性氨基酸。

圖4 pH對茶渣硒蛋白氮溶解指數(shù)的影響

Figure 4 Effect of pH on nitrogen solubility index of selenium-protein from tea residue

茶渣硒蛋白的乳化和起泡性質(zhì)見表5。從測定結(jié)果來看，茶渣硒蛋白具有較好的乳化性，但低于同條件下的大豆分離蛋白(76.4%)，對乳狀液的穩(wěn)定能力則優(yōu)于大豆分離蛋白(63.1%)；起泡性能較差，這與茶渣硒蛋白的溶解性較差有關(guān)，維持泡沫的穩(wěn)定能力較好，但明顯低于大豆分離蛋白(87.4%)[19]35-36。

2.3.4 抗氧化活性 由圖5可知，茶渣硒蛋白對DPPH、ABTS和羥基自由基均具有不同程度的清除活性。在受試濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，清除率均呈持續(xù)增強(qiáng)的趨勢，DPPH、ABTS和羥基自由基清除率的IC50值分別為(0.339 7±0.002 5)，(0.508 0±0.012 1)，(0.305 0±0.002 0) mg/mL。因此，對3種自由基的清除能力表現(xiàn)為：羥基自由基>DPPH自由基>ABTS自由基，且對前兩者的清除率均高于李永富[20]31-33報道的茶渣蛋白的，可能是硒與蛋白之間的協(xié)同抗氧化作用[21]。

表5 茶渣硒蛋白的乳化和起泡性質(zhì)

圖5 茶渣硒蛋白的DPPH、ABTS和羥基自由基清除活性

Figure 5 DPPH, ABTS and hydroxyl radical scavenging activity of selenium-protein from tea residue

3 結(jié)論

茶渣硒蛋白在堿提過程中，多酚類物質(zhì)在堿性、濕熱條件下發(fā)生氧化反應(yīng)，使浸提液形成褐色。采用雙氧水脫色，在添加量為4.0 mL/100 mL、50 ℃下，可達(dá)到(93.78±0.84)%的理想脫色率。pH 3.5下經(jīng)等電點沉淀所得的茶渣硒蛋白的性質(zhì)研究結(jié)果表明，其是富硒茶中硒元素的主要富集部位，且有機(jī)化程度可達(dá)79.37%，滿足了安全補(bǔ)硒的要求；氨基酸組成全面，EAA/NEAA、EAA/TAA的比例符合WHO/FAO的理想模式，谷氨酸、甘氨酸、天門冬氨酸、精氨酸等功能氨基酸均有較高含量；與報道的其他植物蛋白[19]5,35-36[22]的同種功能特性比較，乳化性、乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性較高，溶解性和起泡性則較低，說明其作為乳化劑應(yīng)用于食品加工中的潛在可能性；還具有顯著的抗氧化活性，DPPH、ABTS和羥基自由基的清除率均表現(xiàn)出濃度依賴性。與以往的研究[7]44[19]39[20]41-42相比，本研究對富硒茶茶渣中與硒結(jié)合蛋白的性質(zhì)進(jìn)行了考察，關(guān)注了脫色、沉淀工藝對硒形態(tài)的影響；硒元素的研究中，添加有機(jī)化程度指標(biāo)以表征硒源的安全性。后續(xù)可對茶渣硒蛋白通過改性提高功能特性，并在具體食品模型的應(yīng)用中進(jìn)行研究，以利于其資源的合理利用和富硒茶的全面開發(fā)。