李昕晏 崔杰 李俊良 王琮玉 羅成飛

摘要：逆境脅迫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，在漫長(zhǎng)的進(jìn)化中，植物擁有了一套復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對(duì)不良環(huán)境，在這一套調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miRNA起到了重要作用。本文對(duì)近幾年關(guān)于miRNA及其靶基因調(diào)控作用的研究進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)miRNA的形成過(guò)程和作用機(jī)制進(jìn)行了概括，介紹了與抗逆相關(guān)的miRNA及其靶基因，包括以靶基因?yàn)榭鼓嫦嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄因子的miRNA（miR160/miR167、miR159、miR156和miR164）以及以靶基因?yàn)榭鼓嫦嚓P(guān)結(jié)構(gòu)基因的miRNA（miR398和miR395），可為利用基因工程手段增強(qiáng)植物的抗逆性提供更有效的改良途徑。

關(guān)鍵詞：miRNA;逆境脅迫;轉(zhuǎn)錄因子;結(jié)構(gòu)基因;靶基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S332.1;S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0063-04

收稿日期：2018-09-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31571731）。

作者簡(jiǎn)介：李昕晏（1995—），女，湖南長(zhǎng)沙人，碩士研究生，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。E-mail：496349958@qq.com。

通信作者：崔杰，博士，副教授，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。E-mail：cuijie2006@163.com。

1miRNA概述

microRNA（miRNA）是小的非編碼內(nèi)源性RNA（18～24個(gè)核苷酸），首先在線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）中被發(fā)現(xiàn)，可在突變的秀麗隱桿線蟲(chóng)中暫時(shí)表達(dá)，所以miRNA最初被稱(chēng)為短時(shí)間RNA（stRNA）[1]。植物miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。植物miRNA主要經(jīng)過(guò)以下幾個(gè)過(guò)程產(chǎn)生：首先編碼miRNA的基因依賴(lài)RNA聚合酶Pol Ⅱ復(fù)合體形成長(zhǎng)約1 000 bp的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物呈現(xiàn)不完全配對(duì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨后初級(jí)轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍iRNA，該過(guò)程需要經(jīng)過(guò)2個(gè)步驟，第1步在細(xì)胞核中進(jìn)行，蛋白酶DCL1識(shí)別莖環(huán)結(jié)構(gòu)并對(duì)其進(jìn)行切割，形成前體miRNA，前體miRNA通過(guò)HASTY轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中;第2步在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，ATP依賴(lài)性RNase Ⅲ蛋白Dicer識(shí)別前體miRNA的2 nt 3′突出端，并從其末端去除約21 nt序列形成成熟的miRNA-miRNA*雙鏈體[2]。接著成熟的miRNA雙鏈體展開(kāi)形成22 nt的單鏈成熟miRNA，其與Argonaute蛋白-1（AGO-1）以及其他調(diào)節(jié)蛋白如GW182和聚A結(jié)合蛋白（PABP）一起形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）。最后，成熟的miRNA沉默復(fù)合體（RISC）通過(guò)與靶mRNA轉(zhuǎn)錄物3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）中的區(qū)域進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致靶mRNA翻譯抑制或降解。靶mRNA被抑制還是被降解取決于其與同源miRNA序列的互補(bǔ)程度。在動(dòng)物中miRNA與靶mRNA的相互作用是部分互補(bǔ)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯被抑制，而在植物中是完全互補(bǔ)，會(huì)導(dǎo)致靶基因完全降解[3-4]。

2miRNA在植物抗逆過(guò)程中的作用方式

2.1通過(guò)靶向應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗逆

研究表明，一些miRNA的靶基因可翻譯為與應(yīng)激相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[5-7]。轉(zhuǎn)錄因子是一種蛋白質(zhì)，它能夠與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合，激活或抑制基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子一般有4個(gè)保守的功能區(qū)，分別為DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域（轉(zhuǎn)錄調(diào)控域）、寡聚化位點(diǎn)和核定位信號(hào)。但并不是所有的轉(zhuǎn)錄因子都具有以上所有的功能區(qū)，有些轉(zhuǎn)錄因子沒(méi)有寡聚化位點(diǎn)。DNA結(jié)合域能夠識(shí)別并結(jié)合特定的順式作用元件，其氨基酸序列的特異性決定了轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合的順式作用元件的特異性。轉(zhuǎn)錄調(diào)控域是轉(zhuǎn)錄因子家族的分類(lèi)依據(jù)，同一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族擁有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，根據(jù)對(duì)靶基因作用的差異可將其分為轉(zhuǎn)錄激活域和轉(zhuǎn)錄抑制域。寡聚化位點(diǎn)的存在是轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用形成同源或異源二聚體的條件。核定位信號(hào)是富含精氨酸和賴(lài)氨酸殘基的核定區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)該區(qū)域的調(diào)控進(jìn)入細(xì)胞核[8]。植物中的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多，且廣泛地參與植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，其中一部分轉(zhuǎn)錄因子與抗逆有關(guān)，能夠在植物受到脅迫時(shí)被脅迫信號(hào)激發(fā)，與特定基因的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)從而引起植物發(fā)生生理生化變化，進(jìn)而提高植物抵抗外界環(huán)境壓力的能力。

2.1.1miR160/miR167與轉(zhuǎn)錄因子ARF互作研究

生長(zhǎng)素可調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）是調(diào)節(jié)其下游靶基因表達(dá)的基因。大多數(shù)ARF蛋白由3個(gè)特征結(jié)構(gòu)域組成，即B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD），位于N末端區(qū)域;C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD），位于C-末端區(qū)域，是一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列與Aux/IAA蛋白質(zhì)C-末端的結(jié)構(gòu)域Ⅲ和Ⅳ相關(guān)，允許ARF或ARF和Aux/IAA蛋白的二聚化;賦予活化劑或阻遏物活性的可變中間區(qū)域（MR）。miR160和miR164被發(fā)現(xiàn)靶向ARF轉(zhuǎn)錄因子[9-10]。

在幾種植物物種中觀察到干旱和鹽脅迫條件下，miR393、miR160和miR167的表達(dá)上調(diào)，已有研究證明，鹽度觸發(fā)miR393表達(dá)，導(dǎo)致TIR1和AFB2受體的結(jié)合被抑制，進(jìn)而影響生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11]。而miR160和miR164通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF10、ARF16、ARF17等在植物發(fā)育中起關(guān)鍵作用[12]。miR393/（miR160，miR167）與ARF轉(zhuǎn)錄因子之間存在一個(gè)應(yīng)對(duì)脅迫的調(diào)控途徑，如圖1所示。生長(zhǎng)素受體TIR1通過(guò)釋放AUX/IAA與生長(zhǎng)素響應(yīng)因子形成異二聚體的方式調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)。當(dāng)生長(zhǎng)素水平低時(shí)，ARF與AUX/IAA因子異二聚化。在結(jié)合生長(zhǎng)素時(shí)，TIR1和AFB等受體被激活并使AUX/IAA成員泛素化，使原本因與AUX/IAA結(jié)合而被抑制的ARF得到釋放。這幾種保守的miRNA在生長(zhǎng)素感知和信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用，miR393下調(diào)TIR1和AFB轉(zhuǎn)錄物的含量，miR160和miR167通過(guò)指導(dǎo)mRNA的切割來(lái)下調(diào)5種不同的ARF轉(zhuǎn)錄物的含量。在適宜的生長(zhǎng)條件下，低水平的miR393以及miR160和miR167即可微調(diào)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)素響應(yīng)基因所需的ARF水平。在應(yīng)激期間，miR393的上調(diào)表達(dá)將TIR1保持在較低的水平，有助于抑制生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，從而增加AUX/IAA-ARF異二聚化。此外，miR160和miR167的表達(dá)量在應(yīng)激期間也被上調(diào)，它們的上調(diào)引起ARF的下調(diào)，從而下調(diào)ARF介導(dǎo)的基因表達(dá)。總的來(lái)說(shuō)，ARF介導(dǎo)的基因表達(dá)受到miR393、miR160和miR167的抑制，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)和脅迫下的發(fā)育減弱，促進(jìn)植物對(duì)脅迫的耐受性。

2.1.2miR159與轉(zhuǎn)錄因子MYB互作研究

MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于真核生物中，是植物界最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。MYB蛋白具有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，其由在N末端的1～4個(gè)不完整的串聯(lián)重復(fù)組成。每個(gè)MYB重復(fù)序列編碼3個(gè)α-螺旋，其中第2個(gè)和第3個(gè)螺旋形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，識(shí)別并結(jié)合特定識(shí)別位點(diǎn)C/TAACG/TG處的DNA主溝。前人研究證明，MYB轉(zhuǎn)錄因子被miR159、miR828和miR858等miRNA靶向，其主要調(diào)節(jié)植物在各種脅迫條件下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)育[14]。Gupta等研究表明，在不同脅迫條件下miR159的表達(dá)量有不同的表現(xiàn)，例如在20%聚乙二醇6000滲透脅迫下miR159表達(dá)量被顯著上調(diào)，在鹽脅迫和冷脅迫下miR159表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)[15]，miR159可以通過(guò)控制ABI3的表達(dá)來(lái)調(diào)控MYB33轉(zhuǎn)錄因子的含量，從而參與ABA信號(hào)通路響應(yīng)干旱[16]。

2.1.3miR156與轉(zhuǎn)錄因子SPL互作研究

SPL（SQUAMOSA promoter-binding protein-like）是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于植物中。最初從金魚(yú)草（Antirrhinum majus）中篩選到2個(gè)SPL基因，分別命名為SBP1和SBP2，其因能夠識(shí)別并結(jié)合到SQUAMOSA的啟動(dòng)子上而得名。SPL轉(zhuǎn)錄因子是植物發(fā)育時(shí)間的主要調(diào)節(jié)因子，由miR156在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。最近在擬南芥中的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，miR156介導(dǎo)的SPL2和SPL11表達(dá)量的下調(diào)增強(qiáng)了植物對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)，包括植物的耐熱性[17]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)miR156過(guò)表達(dá)和SPL13 RNA含量降低能夠使紫花苜蓿顯示出對(duì)熱應(yīng)激耐受性的增加，在熱應(yīng)激下表現(xiàn)為水勢(shì)升高，非酶抗氧化劑含量、花青素含量和葉綠素豐度增加[18]。miRNA156同時(shí)被發(fā)現(xiàn)對(duì)植物耐鹽機(jī)制也有作用，在鹽處理?xiàng)l件下，miR156過(guò)表達(dá)基因型中苜蓿中記錄到總氮含量的增加和離子穩(wěn)態(tài)的改變;在嚴(yán)重的鹽度脅迫下，miR156下調(diào)SPL轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)量，間接調(diào)控其他重要轉(zhuǎn)錄因子以及下游鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)[19]。另有研究表明，miR156通過(guò)沉默SPL13減少水分損失和增加氣孔導(dǎo)度、增加葉綠素含量和增強(qiáng)光合同化作用，從而達(dá)到抗旱的作用[20]。

2.1.4miR164與轉(zhuǎn)錄因子NAC互作研究

作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC包含復(fù)雜的植物特異性超家族，并且存在于多種物種中。NAC的首字母縮寫(xiě)詞源自3種最早發(fā)現(xiàn)NAC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，分別為矮牽牛NAM、擬南芥ATAF1/2和CUC2。NAC被證明在植物應(yīng)激反應(yīng)期間在復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，尤其是在非生物脅迫下，NAC在植物中的表達(dá)會(huì)發(fā)生明顯變化[21]。NAC轉(zhuǎn)錄因子被miRNA廣泛靶向。幾項(xiàng)關(guān)于擬南芥和水稻的研究已經(jīng)顯示，miR164通過(guò)切割NAC mRNA調(diào)節(jié)植物發(fā)育過(guò)程，并且能夠響應(yīng)非生物脅迫[22-24]。在水稻中測(cè)試了6個(gè)miR164靶向NAC基因（OMTN1～OMTN6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)參與耐旱性的調(diào)控[22]。在胡楊中也發(fā)現(xiàn)，miR164指導(dǎo)PeNAC070、PeNAC012和PeNAC028 mRNAs的切割，在干旱和鹽脅迫條件下，miR164及其靶基因NAC070在根、葉和莖中的表達(dá)情況不同，總體而言增加了植物的抗旱性和耐鹽性[25]。孫宗艷在對(duì)甜菜抗逆性的研究中發(fā)現(xiàn)，甜菜根中的miR164在鹽處理12 h時(shí)表達(dá)量下降劇烈，葉中的miR164表達(dá)量在處理12 h 時(shí)下降，在處理24 h時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨后又下降，在根和葉中的miR164表達(dá)量都分別與根和葉中的NAC21/22呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[26]。

2.2通過(guò)靶向應(yīng)激相關(guān)結(jié)構(gòu)基因抗逆

2.2.1miR398與CSD基因互作研究

逆境會(huì)引起植物體內(nèi)自由基的積累，超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的活性氧（ROS）清除酶，它催化超氧化物自由基向H2O2和O2轉(zhuǎn)化，該反應(yīng)構(gòu)成了對(duì)氧化應(yīng)激的第1層細(xì)胞防御，植物已經(jīng)進(jìn)化出3種具有不同金屬配體的SOD，即鐵SOD（Fe-SOD）、錳SOD（Mn-SOD）和銅/鋅SOD（Cu/Zn-SOD，也稱(chēng)為CSD），其中Cu/Zn-SOD是植物中的主要銅酶。擬南芥基因組編碼3種CSD同工酶：細(xì)胞質(zhì)中的CSD1、葉綠體中的CSD2和過(guò)氧化物酶體中的CSD3。在擬南芥中，miR398具有4個(gè)靶基因，分別為CSD1、CSD2、CCS和COX5b-1。當(dāng)植物暴露于高光、重金屬（Cu2+和Fe3+）或甲基紫精（MV）條件下時(shí)，miR398的表達(dá)量下調(diào)，引起CSD2表達(dá)量的上調(diào)[27]，進(jìn)而在氧化應(yīng)激下提高植物性能。在高溫脅迫下，miR398表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在miR398的4個(gè)靶標(biāo)中除了COX5b-1之外，其余3個(gè)靶標(biāo)的表達(dá)量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，通過(guò)定點(diǎn)誘變CSD1、CSD2、CCS而產(chǎn)生的3種miR398特性轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比，在37 ℃中對(duì)熱應(yīng)激更加敏感，可積累更高水平的超氧化物自由基[28]。

2.2.2miR395與APS基因互作研究

硫元素參與許多生物功能，并且是多種次級(jí)代謝物的必需元素，包括硫脂、硫酸葡萄糖胺、谷胱甘肽和輔酶。缺硫環(huán)境會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)，因此，硫營(yíng)養(yǎng)對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要。植物可從土壤中獲得無(wú)機(jī)硫酸鹽形式的硫，從大氣中獲得二氧化硫和硫化氫氣體形式的硫。硫酸鹽在同化過(guò)程首先由ATP硫酸化酶催化無(wú)機(jī)硫酸鹽和ATP形成腺苷5′-磷酸硫酸鹽和無(wú)機(jī)焦磷酸鹽。隨后，腺苷5′磷酸硫酸鹽被2種不同的硫酸鹽同化途徑利用。前人對(duì)擬南芥中的4種ATP硫酸化酶編碼基因（APS基因）進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR395靶向APS基因，在硫酸鹽限制期間，3種APS基因在轉(zhuǎn)錄后水平受miR395調(diào)節(jié)，miR395過(guò)表達(dá)植物中的硫酸鹽濃度增加[29-30]。更有研究證明，硫酸鹽濃度與miR395的豐度呈正相關(guān)關(guān)系，即miR395水平升高導(dǎo)致硫酸鹽濃度增加，而miR395豐度的下調(diào)導(dǎo)致硫酸鹽濃度降低。相應(yīng)地，miR395靶向的APS基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致硫酸鹽濃度的下降[31]。有研究在鎘脅迫下鑒定了過(guò)表達(dá)miR395的轉(zhuǎn)基因油菜，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR395的植物表現(xiàn)出比野生型更低程度的鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，相比之下，轉(zhuǎn)化體中的葉綠素、谷胱甘肽和非蛋白質(zhì)硫醇含量高于野生型[32]。

3展望

非生物脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響很大[33]，植物進(jìn)化出了一套復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)不良環(huán)境。非生物脅迫誘導(dǎo)miRNA的異常表達(dá)，miRNA位于調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的基因網(wǎng)絡(luò)中心，使得miRNA成為改良農(nóng)作物遺傳性狀的重要新靶標(biāo)，包括植物對(duì)環(huán)境脅迫的反應(yīng)。前人研究已經(jīng)確定，miRNA的調(diào)控是通過(guò)與靶基因完全或不完全結(jié)合的方式來(lái)完全降解靶基因或抑制靶基因的翻譯過(guò)程，進(jìn)而起到對(duì)靶基因不同程度的抑制作用。前人鑒定了多種植物中的miRNA，并且研究了各個(gè)miRNA的靶基因以及在不同脅迫下miRNA和其靶基因的表達(dá)量變化，分析其在植物抗逆中的作用。但總的來(lái)說(shuō)，對(duì)于miRNA的研究大多數(shù)還是以不同物種中miRNA的鑒定為主，對(duì)于其在整體逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作用的研究較少，根據(jù)現(xiàn)有的研究可以總結(jié)出，植物中的miRNA既有靶向應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的，也有靶向應(yīng)激相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的，最終使植物在生理生化上作出應(yīng)對(duì)脅迫的改變。今后應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，更深入地探討miRNA在抗逆調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的功能，進(jìn)而更好地指導(dǎo)農(nóng)作物的改良，增加作物產(chǎn)量，優(yōu)化作物質(zhì)量。

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