胡平 王艷 許爭峰

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、南京市婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，江蘇 南京 210004)

我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%[1]，很大一部分是由染色體畸變所引起，主要包括染色體數(shù)目異常、大片段異常和染色體微缺失微重復(fù)。染色體畸變涉及多個基因，可引起多種組織和器官發(fā)育異常，絕大部分癥狀嚴重，且無有效治療手段，受累終生，危害嚴重，產(chǎn)前診斷是現(xiàn)階段預(yù)防染色體畸變的最重要手段。

有別于常規(guī)的出生后遺傳病診斷，產(chǎn)前診斷有著明顯的特點和困難。首先，由于在宮內(nèi)，胎兒癥狀無法進行直接觀察，也不能獲得更多的輔助檢查信息，導(dǎo)致很多重要的臨床信息丟失；其次，胎兒發(fā)育異?；蛘呋斡兄軓姷倪z傳異質(zhì)性，同一種表型可能涉及幾十種染色體綜合征；另外，很多染色體綜合征臨床表型有著不同的表現(xiàn)度或外顯率，往往同一種綜合征在胎兒期有著很大的表型差異，尤其是有些微缺失/微重復(fù)在胎兒時期臨床表征一般較少較輕、線索很少，很容易漏診。因此，高效、理想的產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)包含以下技術(shù)特征：高分辨率、快速、全基因組檢測，可同時檢測基因組劑量變化和染色體結(jié)構(gòu)變異。

核型和染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術(shù)現(xiàn)已成為了產(chǎn)前診斷的一線技術(shù)。核型作為染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn)已使用多年，可檢測大的結(jié)構(gòu)變異和染色體數(shù)量變化，但是其分辨率低，小于5～10M就無法檢測，費時費力，通量難以提升，且存在一定的培養(yǎng)失敗風(fēng)險。相比于核型分析，CMA技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、精準(zhǔn)、客觀、通量高的優(yōu)勢，可以檢測出染色體數(shù)目異常、大片段異常、微缺失微重復(fù)、單親二倍體(uniparental disomy，UPD)、三倍體等，但是無法檢測結(jié)構(gòu)變異。兩者聯(lián)合應(yīng)用可以基本覆蓋所有的染色體畸變以及結(jié)構(gòu)異常，滿足產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷的需求，大大提升了檢測的陽性率。其他的檢測技術(shù)如FISH、MLPA、QF-PCR、BOBs等，逐漸成為了輔助補充手段，在特定情況下使用。

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為染色體畸變以及拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)檢測提供了新的手段。2009年BMCBioinformatics首次報道了一種名叫拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)的技術(shù)，可以在全基因組范圍內(nèi)檢測CNV。CNV-seq對DNA進行全基因組低深度高通量測序，采用短序列比對分析和counts計算統(tǒng)計來檢出CNV；該技術(shù)與芯片有著完全不同的原理，一個是基于DNA分子雜交信號計算，一個是基于比對counts的計算統(tǒng)計，但均可以實現(xiàn)CNV的檢測。該技術(shù)的出現(xiàn)為CNV的檢測提供了一種新的方案，且和芯片一樣具有快速、方便、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，豐富了CNV檢測的技術(shù)方法。

CNV-seq技術(shù)首先被用于果蠅的染色體CNV檢測以及腫瘤基因組的檢測[2，3]，后續(xù)被逐漸用于人類遺傳病相關(guān)CNV檢測。2013年Hayes JL[4]報道了對39例兒童樣本進行了aCGH芯片(8×60K, BlueGnome)和CNV-seq檢測的比較分析，CNV-seq對11例陽性均檢出，與芯片有著很好的一致性。2014年Liang D[5]采用SNP-array和CNV-seq對72例(62例兒童和10例流產(chǎn)樣本)樣本進行染色體綜合征的檢測比較分析，發(fā)現(xiàn)SNP-array和CNV-seq的一致性為100%。2015年Liu S[6]對64例流產(chǎn)物采用CNV-seq與核型進行了平行比對，CNV-seq除了1例三倍體無法檢測漏檢，其他非整倍體檢出完全一致，還意外發(fā)現(xiàn)了一個核型漏檢的22q11.2微缺失。2015年Cohen K[7]采用CNV-seq技術(shù)對aCGH(BlueGnome)檢測失敗的9例產(chǎn)前診斷樣本進行分析，準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)了致病性CNV，證明了CNV-seq對于DNA質(zhì)量不好的樣本也可以有效檢測。這些小規(guī)模的研究提示CNV-seq技術(shù)對于染色體畸變檢測具有應(yīng)用潛力。

后續(xù)開展了一些更大規(guī)模的產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用評估研究。2016年許爭峰團隊[8]報道了CNV-seq(low-pass sequencing)對多種樣本類型共計570例的大樣本檢測分析，包括流產(chǎn)、死產(chǎn)、羊水、臍帶血、外周血，檢出的陽性樣本均得到了驗證。2016年Zhu XY[9]采用CNV-seq和SNP-array(Affymetrix CYTOSCAN HD)芯片對115例先天性心臟病胎兒樣本進行比對分析，發(fā)現(xiàn)兩者均檢出21例染色體畸變，一致性為100%。2018年報道[10]采用CNV-seq進行大規(guī)模的臨床前瞻性研究，在3398例超聲檢查正常和軟指標(biāo)異常的產(chǎn)前診斷樣本中，發(fā)現(xiàn)3%(112例)異常，所有染色體異常均得到驗證，相比于核型可以增加0.97%的陽性檢出率。2018年Wang J[11]開展了3429例產(chǎn)前診斷樣本前瞻性研究，分為3類樣本：高齡、高風(fēng)險、超聲軟指標(biāo)，檢出的致病性染色體異常均得到了驗證，CMA與CNV-seq有著良好的一致性，作者提出CNV-seq可作為產(chǎn)前診斷的一線檢測手段。

這些研究證實了CNV-seq是一種染色體畸變分析的可行手段，可檢測全基因組范圍內(nèi)的包括染色體非整倍體、大片段異常、微缺失微重復(fù)，為CNV的檢測提供了一種快速方便的新型技術(shù)手段，CNV-seq對于染色體畸變的檢測準(zhǔn)確性與芯片相當(dāng)。此外，與芯片相比，CNV-seq存在以下優(yōu)勢：①對于DNA樣本的兼容性高和需求量更小，最低僅需要10～50ng基因組DNA，遠低于芯片的200ng。臨床實踐中部分的新鮮羊水DNA樣本量確實較少，且DNA完整性欠佳，不能達到芯片的上樣質(zhì)控要求，而CNV-seq可以克服這些缺點，適合羊水等產(chǎn)前樣本。②隨著測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，測序成本不斷下降，CNV-seq在價格方面有著明顯的優(yōu)勢，價格比芯片便宜很多，降低了該技術(shù)的應(yīng)用門檻，讓更多的患者得到此項技術(shù)服務(wù)。③近幾年高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了大量推廣和普及，CNV-seq所需要的測序儀是可以與其他項目如NIPT共用，可以一機多用，避免了額外購買昂貴的染色體芯片專用設(shè)備，因此CNV-seq技術(shù)的普及和推廣也更容易。作為一種新型的技術(shù)，CNV-seq很大程度上解決了很多機構(gòu)對于CNV的檢測問題，引起了業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注，2019年鄔玲倩等發(fā)表了CNV-seq產(chǎn)前診斷的專家共識，對該技術(shù)的臨床應(yīng)用進行了規(guī)范，對于該技術(shù)以后的應(yīng)用推廣起到了良好的促進作用。

值得注意的是，現(xiàn)階段CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用仍要注意以下問題：①相比于核型與CMA，CNV-seq無法檢測UPD、多倍體和結(jié)構(gòu)變異，會導(dǎo)致漏診，建議采用QF-PCR結(jié)合CNV-seq可以同時檢測出多倍體。②相比于芯片，芯片探針的位點設(shè)置和選擇是有偏向性的，在致病基因區(qū)域設(shè)置的探針更密更多，CNV-seq由于是全基因組隨機測序，測序位點沒有偏向，測序覆蓋的均一性更好，也可以檢測出更多的CNV。因此，會增加更多的VOUS，盡管有助于新基因的發(fā)現(xiàn)，但是在臨床中也額外增加了分析解讀和臨床咨詢的工作量。③市場上主流的芯片，其探針位點往往多是經(jīng)過大量樣本的多輪測試和挑選，已經(jīng)是一個標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品，成熟穩(wěn)定可靠，每款的檢測效能是非常明確的。CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化方面仍然需要加強提升，不同的測序儀器、測序體系、測序深度、測序方案以及分析計算算法[12]，都會影響著結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性，尤其是CNV斷點的判斷準(zhǔn)確性是否可靠，有時候這對于產(chǎn)前診斷CNV分析十分重要。④迄今為止，CNV-seq在臨床應(yīng)用的文獻報道仍然不多，僅僅十余篇，而在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用研究更少，集中在我國幾個實驗室，對于CNV-seq在產(chǎn)前診斷中的全面評估，現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯然是不夠的。仍然需要更多的研究數(shù)據(jù)支撐，尤其缺乏一些與核型或者CMA的平行比較研究和多中心聯(lián)合評估研究，特別是評估CNV-seq對病理性CNV的檢測靈敏度、特異性、適應(yīng)證等，需要更為明確的數(shù)據(jù)，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供精確和全面的信息。

隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展和遺傳診斷要求的不斷提高，整合CNV和結(jié)構(gòu)變異(structural variation，SV)是大勢所趨。染色體SV是芯片技術(shù)無法克服的困難，但已有文獻報道測序技術(shù)可以解決這個問題，CNV-seq技術(shù)如果能整合檢測SV的功能，克服芯片的這個缺陷，將CNV和SV檢測結(jié)合在一個體系中完成，提高檢測效率、節(jié)省檢測成本、節(jié)約時間，或許可以替代現(xiàn)有的核型和芯片檢測技術(shù)，顯著提升出生缺陷遺傳病的防控水平。