謝躍洋， 李 琦， 陳 楠， 魏茂凱， 張志峰

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，山東 青島 266003)

SOX(SRY-related HMG-box)家族是一類具有HMG-box結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與脊椎動物的性別決定、組織器官形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生等生物學(xué)過程的調(diào)控[1-3]。該家族包含30多個成員，分別屬于10個亞家族(A～J)[4]，其中SOXB亞家族由一些具有Group B homology基序的成員組成，根據(jù)氨基酸序列特征及功能該亞族又可分為SOXB1亞族和SOXB2亞族。脊椎動物的SOXB1亞家族包含SOX1、SOX2、SOX3和SOX19，SOXB2亞家族包含SOX14和SOX21[5]。SOXB亞族成員主要在動物的神經(jīng)系統(tǒng)和消化道中表達(dá)。Avilin等報道SOX2在小鼠受精后8.5 d胚胎的頭褶、神經(jīng)外胚層及神經(jīng)管中表達(dá)，之后在腦、感覺基板和腸內(nèi)胚層表達(dá)[6]；在非洲爪蟾中，SOX2表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]；SOX14在雞的后腦、內(nèi)耳及視覺蓋中表達(dá)[8]。在無脊椎動物中，soxb亞族基因主要在神經(jīng)元細(xì)胞、腹神經(jīng)索、感覺器官[9-14]及消化道(非洲海參Holothuriaglaberrima的腸道[15]及紫色球海膽Strongylocentrotuspurpuratus的前腸[14])中表達(dá)；在果蠅(Drosophilamelanogaster)中Dichaete(隸屬于SOXB2亞族)的敲降會影響成神經(jīng)細(xì)胞的分化并造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分缺失[16-17]。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)隸屬螠蟲動物門(Echiuroidea)，主要分布于俄羅斯、朝鮮半島、我國的黃渤海和日本北海道、本洲島等海區(qū)。消化道是動物進(jìn)行食物消化和吸收的場所，對消化道發(fā)生、發(fā)育等的研究將有助于人們對動物消化道結(jié)構(gòu)和消化生理等的認(rèn)識[18-20]。目前，人們對單環(huán)刺螠消化道發(fā)生、成體消化道的組織學(xué)結(jié)構(gòu)以及幼蟲中的消化酶特性等已有了一些認(rèn)識[21-22]。本實(shí)驗前期獲得的單環(huán)刺螠幼蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在消化道發(fā)生和發(fā)育的不同時期幼蟲中SOXB亞族成員soxb1和soxb2的表達(dá)顯著差異。為了揭示它們在單環(huán)刺螠消化道形成過程中的表達(dá)特征，本研究采用RACE技術(shù)克隆了二者的全長cDNA序列，并通過原位雜交技術(shù)確定其在胚胎及幼蟲中的細(xì)胞學(xué)定位，旨在為探索該亞族基因在螠蟲動物消化系統(tǒng)中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

成體單環(huán)刺螠購自青島市四方路海產(chǎn)品市場，產(chǎn)地為萊州海區(qū)。選擇生殖期的雌、雄個體(體重為(28.7±8.6) g)，解剖腎管以獲取成熟的兩性配子，體外人工授精(精卵比為10∶1)后，將受精卵置于盛有50 L過濾海水的培養(yǎng)箱(50 cm×40 cm×40 cm)中進(jìn)行孵化和培育。孵化期間水溫為16.9 ℃，pH為7.8±0.06，鹽度為29±1，微弱充氣。受精后24 h，早期擔(dān)輪幼蟲孵出；受精后36 h開始投喂小球藻(Chlorellavulgaris)及牟氏角毛藻(Cheatocerosmuelleri)，每天早晚各投喂1次并隨著幼蟲發(fā)育逐漸增加投餌量；發(fā)育為體節(jié)幼蟲后轉(zhuǎn)入含泥沙底質(zhì)的培養(yǎng)箱中，底質(zhì)厚約6 cm。幼蟲培養(yǎng)期間，水溫17～20 ℃，每天換水2次，每次換水量不超過原體積的1/2。培養(yǎng)期間，定期于顯微鏡下觀察胚胎和幼蟲的發(fā)育，并分別取受精卵、二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲(早期、中期和晚期)、體節(jié)幼蟲、蠕蟲狀幼蟲等樣本，于4%多聚甲醛中固定16 h(4 ℃)，梯度甲醇脫水后，保存于無水甲醇中(-20 ℃)，用于整體原位雜交。此外，取部分晚期擔(dān)輪幼蟲，于液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于提取總RNA。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取上述凍存的單環(huán)刺螠晚期擔(dān)輪幼蟲樣本，采用異硫氰酸胍法[23]提取幼蟲總RNA，使用RNase-free的DNase I消除基因組DNA，使用紫外光分光光度計和1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。使用SMARTer[TM]- RACE kit(Clontech，美國)并按照說明書合成RACE-ready cDNA。

1.3 靶基因全長cDNA克隆及序列分析

從單環(huán)刺螠幼蟲轉(zhuǎn)錄組中獲得soxb1及soxb2 cDNA 片段序列并設(shè)計RACE 特異引物(見表1)，以單環(huán)刺螠晚期擔(dān)輪幼蟲的cDNA為模板，用SMARTerTM- RACE kit分別進(jìn)行3’和5’擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收、連接pMD19-T載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗證后送往華大基因測序。使用SeqMan軟件分別將得到的soxb1及soxb2的3’ RACE和5’RACE序列進(jìn)行拼接得到全長cDNA序列。通過NCBI在線BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性分析，分析目的蛋白序列與其他物種蛋白序列的一致性。使用MEGA7.0 軟件進(jìn)行多序列比對并采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap為1 000次重復(fù)檢測其置信度。

表1 RACE引物序列Table1 Sequences of RACE primers

1.4 原位雜交

根據(jù)Uu-soxb1及Uu-soxb2全長cDNA序列設(shè)計探針合成引物(見表2)，PCR擴(kuò)增分別獲得長度為424 bp(Uu-soxb1)和545 bp(Uu-soxb2)的序列。以該序列為模板，使用DIG RNA Labeling kit(SP6 /T7)并按照操作指南合成地高辛標(biāo)記的正義和反義 RNA 探針。

表2 原位雜交探針引物序列Table 2 primer sequence of probes for in situ hybridization

取無水甲醇中保存的各期胚胎和幼蟲樣品，梯度甲醇復(fù)水；蛋白酶K(100 ng/mL)37 ℃下消化20 min(胚胎及擔(dān)輪幼蟲)或者30 min(體節(jié)幼蟲及蠕蟲狀幼蟲)，其他步驟參考Fabioux等[24]的方法并使用地高辛RNA探針和DIG Nucleic Acid Detectionkit(Roche)進(jìn)行整體原位雜交，于Nikon E80i 顯微鏡下觀察和拍照。此外，取4 mm蠕蟲狀幼蟲按照常規(guī)石蠟切片方法，制備厚度為4 μm的組織切片并粘貼到涂有0.1%多聚賴氨酸的載玻片上，按照馮政夫等[25]的方法進(jìn)行切片原位雜交，蛋白酶K(濃度為50 ng/mL)作用時間為15 min。

2 結(jié)果

2.1 靶基因全長cDNA序列的特征

使用SeqMan軟件，將RACE擴(kuò)增獲得的Uu-soxb1和Uu-soxb2的3’和 5’cDNA序列片段拼接得到靶基因的全長cDNA序列。Uu-soxb1 cDNA全長1 871bp(GenBank acc. no.MG921310)，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長度為1 110 bp，編碼369個氨基酸，5’非翻譯區(qū)(Untranslated region，UTR)為114 bp，3’UTR為647 bp；Uu-soxb2 cDNA序列全長2 906 bp(GenBank acc. no.MG921311)，ORF長度為897 bp，編碼298個氨基酸，5’UTR為319 bp，3’UTR為1 690 bp。

同源性分析表明，Uu-SOXB1蛋白與合浦珠母貝(Pinctadafucata)SOX2、沙蠶(Platynereisdumerilii)SOXB1的一致性分別為66%和59%。Uu-SOXB2與紫色球海膽和紅色球海膽(Pseudocentrotusdepressue)的SOXB2一致性均為69%，與褐家鼠(Rattusnorvegicus)、大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)和人(Homosapiens)的SOX14一致性均為54%。多序列比對結(jié)果顯示，本實(shí)驗獲得的兩個單環(huán)刺螠預(yù)測氨基酸序列均具有SOX家族的HMG-box保守區(qū)和B亞族特有的同源區(qū)Group B homology；Uu-SOXB2具有脊椎動物SOX21蛋白羧基端特有的Poly-Ala區(qū)域，但單環(huán)刺螠兩個SOXB亞族成員中均未見哺乳動物所特有的Poly-Gly、PRD repeat和Ser rich區(qū)域(見圖1)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Uu-SOXB1首先與軟體動物長牡蠣(Crassostreagigas)及環(huán)節(jié)動物愛勝蚓(Eiseniafetida)的SOX2聚類，其次與半索動物聚類，最后與脊椎動物聚類；Uu-SOXB2首先與沙蠶聚類，然后與半索動物以及脊椎動物聚類(見圖2)。

2.2 單環(huán)刺螠soxb1和soxb2在其胚胎和幼蟲中的空間定位

整體原位雜交結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠soxb1 mRNA陽性信號在受精卵、二細(xì)胞、四細(xì)胞、囊胚及原腸胚中均呈彌散狀分布(見圖3 A～F)。至早期擔(dān)輪幼蟲時，Uu-soxb1 mRNA的陽性信號仍分散于整個蟲體中，但幼蟲上半球的信號強(qiáng)度似乎稍強(qiáng)于下半球(見圖3 G)；中期和晚期擔(dān)輪幼蟲中，陽性信號主要位于幼蟲的體后部(口后纖毛環(huán)之后)(見圖3 H～I(xiàn))。但至體節(jié)幼蟲和蠕蟲狀幼蟲(400 μm)時，明顯的陽性信號轉(zhuǎn)移至體壁及消化道處(見圖3 J～K)。當(dāng)發(fā)育至4 mm蠕蟲狀幼蟲時，陽性信號主要位于后部腸道及體壁處(見圖3 L)。

Uu-soxb2 mRNA原位雜交結(jié)果顯示，陽性信號在受精卵、卵裂期胚胎、囊胚及原腸胚中均為彌散性分布(見圖4 A～F)。至早期擔(dān)輪幼蟲，陽性信號主要位于頂纖毛束的基部及幼蟲體后部(口后纖毛環(huán)之后)；中期擔(dān)輪幼蟲中，陽性信號主要位于口前纖毛環(huán)及蟲體的下半球；晚期擔(dān)輪幼蟲時，陽性信號主要位于下半球(見圖4 G～I(xiàn))。體節(jié)幼蟲中的陽性信號集中在消化道和體壁內(nèi)側(cè)(見圖4 J)；蠕蟲狀幼蟲中的靶基因mRNA則主要位于消化道、體壁及腹神經(jīng)索(見圖4 K)。當(dāng)發(fā)育至4 mm蠕蟲狀幼蟲時，陽性信號主要位于消化道和體壁中(見圖4 L)。

3 討論

本研究獲得了單環(huán)刺螠兩個cDNA全長序列。分析兩個預(yù)測的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的SOXB蛋白具有高度的同源性，二者均具有HMG-box結(jié)構(gòu)域和SOXB 亞族蛋白特有的Group B homology基序，且與其他物種的HMG-box氨基酸序列一致性高達(dá)97%、Group B homology一致性高達(dá)87%以上。聚類分析結(jié)果顯示，兩個靶序列分別與其他物種的SOXB1和SOXB2聚類。一些學(xué)者認(rèn)為，兩側(cè)對稱動物中的SOXB1和SOXB2可以通過HMG-box序列第2位和第78位氨基酸殘基的種類作為區(qū)分特征，其中SOXB1第2位是精氨酸(R)、第78位是蘇氨酸(T)；而SOXB2則是第2位的組氨酸(H)和第78位的脯氨酸(P)[5,26]。比較本研究獲得的兩個序列，我們發(fā)現(xiàn)一個SOXB序列符合SOXB1的HMG-box氨基酸特征，另一個符合SOXB2的序列特征，由此認(rèn)為，本研究獲得的兩個全長cDNA序列分別是單環(huán)刺螠soxb1和soxb2，定名為Uu-soxb1和Uu-soxb2。

對NCBI數(shù)據(jù)庫中已報道的SOXB進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)SOXB特異的氨基酸序列在無脊椎動物和脊椎動物之間存在差異，脊椎動物SOXB亞族所具備的特有序列在多數(shù)無脊椎動物中是缺失的。在脊椎動物中，SOXB1除了含有SOXB亞族的Group B homology基序外，不同的SOXB1成員還含有各自獨(dú)特的序列特征，例如：SOX1具有2個Poly-glycine、4個Poly-alanine、1個PRD repeat基序(富含組氨酸和脯氨酸)；SOX2具有1個Poly-glycine、1個Ser-rich區(qū)；SOX3具有3個Poly-glycine、1個Pro-rich區(qū)；SOX19不具有特殊氨基酸序列。在SOXB2亞家族成員中，SOXB21具有3個Poly-alanine區(qū)，SOX14不具有特殊序列[4]。然而，在當(dāng)前已報道的無脊椎動物SOXB氨基酸序列中，上述特有序列幾乎都是缺失的，僅在沙蠶的SOXB2、紫海膽的SOX21、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)的SOXB2和仿刺參的SOX21氨基酸序列中具有脊椎動物SOX21特有的Poly-alanine區(qū)域[4]。本研究結(jié)果顯示，單環(huán)刺螠SOXB1也不包含任何脊椎動物SOXB1亞家族成員所具有的特殊序列；SOXB2與沙蠶等的SOXB2特征一致，具有脊椎動物SOX21特有的Poly-alanine。由此，我們認(rèn)為單環(huán)刺螠SOXB氨基酸序列與已報道的無脊椎動物序列特征基本一致。

(Ⅰ.HMG-box結(jié)構(gòu)域; Ⅱ.Group B homology基序; Ⅲ.脊椎動物SOXB特有的Poly-Ala區(qū)域; Ⅳ.哺乳動物SOXB1特有的Poly-Gly區(qū)域; Ⅴ.哺乳動物SOX1特有的富含脯氨酸和組氨酸的PRD-repeat基序; Ⅵ.脊椎動物SOX2特有的Ser-rich區(qū)域; Ⅶ.脊椎動物SOX3特有的Pro-rich區(qū)域。Ⅰ. HMG-box; Ⅱ. Group B homology motif; Ⅲ. Poly-Ala region of vertebrate SOXB; Ⅳ. Poly-Gly region of mammal SOXB1; Ⅴ. PRD-repeat (rich of Pro and His) motif of mammal; Ⅵ. Ser-rich region of vertebrate SOX2; Ⅶ. Pro-rich region of vertebrate SOX3.)

圖2 不同物種SOXB蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

(A～L: Uu-soxb1 mRNA反義探針的原位雜交，藍(lán)色為陽性信號；a～f：Uu-soxb1 mRNA正義探針的原位雜交。 A：受精卵；B：二細(xì)胞；C：四細(xì)胞；D：八細(xì)胞；E：囊胚；F：原腸胚；G：早期擔(dān)輪幼蟲；H：中期擔(dān)輪幼蟲；I：晚期擔(dān)輪幼蟲；J：體節(jié)幼蟲；K：蠕蟲狀幼蟲(400 μm)；L：蠕蟲狀幼蟲(4 mm)正中縱切；L1：L圖的局部放大，示體壁和腸道細(xì)胞. AN：肛門； BW：體壁；DG：消化道；M：體壁乳突；OR：口部；VNC：腹神經(jīng)索；VS：腹棘。A～L: in situ hybridization with anti-sense probe, the positive signals are in blue; a～f: negative controls are indicated with Uu-soxb1 mRNA sense probe. A: fertilized egg; B: 2-cells; C: 4-cells; D: 8-cells; E: blastula; F: gastrula; G: early-trochophore; H: mid-trochophore; I: late-trochophore; J: somite larva; K: worm-like larva (400 μm); L: median longitudinal section of worm-like larva at 4 mm; L1: amplification of the box in figure L, showing the cells of body wall and digestive gut. AN: anus; BW: body wall; DG:digestive gut; M: mastoid of body wall; OR: oral; VNC: ventral nerve cord; VS: ventral seta.)

(A～L: Uu-soxb2 mRNA反義探針的原位雜交，藍(lán)色為的陽性信號；a～f：Uu-soxb2 mRNA正義探針的原位雜交. A：受精卵；B：二細(xì)胞；C：四細(xì)胞；D：八細(xì)胞；E：囊胚；F：原腸胚；G：早期擔(dān)輪幼蟲；H：中期擔(dān)輪幼蟲；I：晚期擔(dān)輪幼蟲；J：體節(jié)幼蟲；K：蠕蟲狀幼蟲(400 μm)；L：蠕蟲狀幼蟲(4 mm)正中縱切；L1：L圖的局部放大，示體壁細(xì)胞。 AN：肛門；DG：消化道；M：體壁乳突；OR：口部；VNC：腹神經(jīng)索；VS：腹棘。A～L: in situ hybridization with anti-sense probe, the positive signals are in blue; a～f: negative controls are indicated with soxb2 mRNA sense probe. A: fertilized egg; B: 2-cell; C: 4-cell; D: 8-cell; E: blastula; F: gastrula; G: early-trochophore; H: mid-trochophore; I: late-trochophore; J: somite larva; K: worm-like larva (400 μm); L: median longitudinal section of juvenile at 4 mm; L1: amplification of the box in figure L. AN: anus; DG: digestive gut; M: mastoid of body wall; OR: oral; VNC: ventral nerve cord; VS: ventral seta.)

Soxb在動物胚胎和幼蟲中的表達(dá)特征已在幾種無脊椎動物中報道，總體而言，它們的表達(dá)特征既有相同又存在一定的差異。首先，soxb是否是母源性表達(dá)存在物種間差異。本研究發(fā)現(xiàn)，Uu-soxb1和Uu-soxb2均在受精卵及早期胚胎中表達(dá)，顯示其為母源性表達(dá)特征，與小頭蟲(Capitellateleta)的soxb1、soxb及紫色球海膽的soxb1表達(dá)特征一致[27-28]，但與密西西比水母(Mnemiopsisleidyi)的sox1及櫛水母(Pleurobrachiapileus)的sox3不同，后者最早在原腸胚的神經(jīng)外胚層中檢測到陽性信號[13,29]；此外，歐洲帽貝(Patellavulgata)的soxbmRNA最早在八細(xì)胞中檢測到[30]。由此可見，soxb在動物早期胚胎中的起始表達(dá)時間存在多樣性。

其次，soxb在動物幼蟲發(fā)育過程中的表達(dá)圖式存在差異。本研究我們揭示Uu-soxb1及Uu-soxb2 mRNA在單環(huán)刺螠幼蟲發(fā)育過程中，其陽性信號多呈局域性分布，并在最后一個幼蟲階段——蠕蟲狀幼蟲中定位于消化道和體壁中。這種由廣布到區(qū)域性分布的表達(dá)圖式在小頭蟲、紫色球海膽、櫛孔扇貝及櫛水母中亦有所報道[13,27-28,31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在擔(dān)輪幼蟲中兩基因的表達(dá)定位于不同的區(qū)域，Uu-soxb1 mRNA主要集中于幼蟲的上半球，之后的幼蟲時期該區(qū)域表達(dá)減弱，這與小頭蟲soxb1及紫色球海膽soxb1的表達(dá)特征類似，幼蟲時期目的基因的表達(dá)亦主要集中在蟲體的上半球[14,27]；而Uu-soxb2 mRNA則集中于頂纖毛環(huán)基部及后口纖毛環(huán)下部，Jager等對櫛水母幼蟲的研究中亦發(fā)現(xiàn)櫛水母sox3在前感覺器官、頂器中檢測到的表達(dá)[13]，這一不同可能是由于形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的。由此可見，soxb在無脊椎動物的幼蟲發(fā)育過程中多呈現(xiàn)局域性分布的特征。

在擔(dān)輪幼蟲之后的發(fā)育中Uu-soxb1及Uu-soxb2 mRNA表現(xiàn)相似的表達(dá)特征，在體節(jié)幼蟲及蠕蟲狀幼蟲中，均主要集中于幼蟲消化道及體壁的乳突處。已有研究顯示，soxb1在非洲海參的腸道、紫色球海膽的前腸、文昌魚的后腸中均有表達(dá)，soxb2的同源基因Dichaete也在果蠅后腸中檢測到表達(dá)信號[14-15,32-33]，提示soxb亞族基因在動物消化道發(fā)育中的功能是保守的。然而，它們在消化道組織細(xì)胞中的表達(dá)存在時空差異性，在果蠅、海膽、海參及文昌魚中soxb亞族基因mRNA表達(dá)于孵化前個體的消化道中，而在單環(huán)刺螠中Uu-soxb1及Uu-soxb2則在發(fā)育時期較晚的體節(jié)幼蟲腸道中檢測到陽性信號，Uu-soxb1在蠕蟲狀幼蟲中僅局限于后部腸道。我們認(rèn)為soxb亞族基因在不同物種之間的時空表達(dá)差異可能與物種各自的發(fā)育時空特異性相關(guān)，但尚需更多的研究數(shù)據(jù)證明。