■肖 毅 肖兵南 蔣小文 朱幸輝 劉瑩瑩

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南民康生物技術(shù)研究所，湖南長(zhǎng)沙410022；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙410131）

目前改善糟粕品質(zhì)、提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最常用的方法是生物發(fā)酵。發(fā)酵菌種主要是芽孢桿菌、酵母菌[1]、霉菌[2]和乳酸菌等。這些菌種的合理組合發(fā)酵可提高糟粕的飼用價(jià)值[3]，同時(shí)為動(dòng)物提供益生菌和消化酶，有利于動(dòng)物的抗病促生長(zhǎng)[4-5]。食用菌是優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)食品，近年來(lái)廣泛開(kāi)展菌絲體發(fā)酵生產(chǎn)保健食品和保健藥物[6]。用食用菌菌絲體發(fā)酵粗飼料可以提高飼料中蛋白含量、提高動(dòng)物的免疫力和生長(zhǎng)速度[7]。然而用食用菌發(fā)酵糟粕等粗飼料，尤其是與其它真菌和細(xì)菌混合發(fā)酵的研究報(bào)道較少。本研究用食用真菌和生理活性互補(bǔ)性強(qiáng)的其它菌種聯(lián)合發(fā)酵糟粕等農(nóng)副產(chǎn)品，生產(chǎn)高活性生物飼料，以提高非常規(guī)飼料的利用率。

糟粕發(fā)酵為固體發(fā)酵，現(xiàn)有固體發(fā)酵設(shè)備除傳統(tǒng)的發(fā)酵桶和發(fā)酵池外，有淺盤(pán)發(fā)酵反應(yīng)器、流化床發(fā)酵反應(yīng)器、轉(zhuǎn)鼓式發(fā)酵反應(yīng)器、圓盤(pán)式發(fā)酵反應(yīng)器、攪拌式發(fā)酵反應(yīng)器、壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器[8]。但目前在工業(yè)上已得到應(yīng)用的還只有盤(pán)式、轉(zhuǎn)鼓式及攪拌式反應(yīng)器，國(guó)內(nèi)對(duì)各種性能固態(tài)反應(yīng)器的研制還剛剛開(kāi)始[9]。由于必須解決反應(yīng)器的過(guò)程放大、防止發(fā)酵過(guò)程污染及過(guò)程監(jiān)控等一系列問(wèn)題，在考慮研制新型固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器時(shí)，強(qiáng)制通風(fēng)和溫控、物料不宜長(zhǎng)時(shí)間處于靜止?fàn)顟B(tài)、能增溫、機(jī)械化程度高、易于操作、便于清洗消毒和投資少等因素是關(guān)鍵。到目前為止尚未見(jiàn)到有關(guān)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器產(chǎn)品，飼料發(fā)酵除用轉(zhuǎn)鼓式或攪拌式發(fā)酵罐生產(chǎn)菌種外，商品生產(chǎn)大多采用發(fā)酵池（槽）、發(fā)酵桶發(fā)酵，在發(fā)酵中作翻攪或不翻攪，發(fā)酵物料未經(jīng)消毒滅菌，發(fā)酵過(guò)程難以控制，易染雜菌，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定。發(fā)酵設(shè)備影響著生物發(fā)酵工藝與效果，是制約固體發(fā)酵工業(yè)發(fā)展的瓶頸。

為克服上述問(wèn)題的不足，本文設(shè)計(jì)了一種發(fā)酵糟粕生產(chǎn)高活性高營(yíng)養(yǎng)飼料的設(shè)備，并進(jìn)行糟粕發(fā)酵試驗(yàn)及效果評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵設(shè)備

本研究使用并測(cè)定的設(shè)備為層架循環(huán)履帶發(fā)酵床式發(fā)酵箱（自行研發(fā)），主要組成如下：

1.1.1 箱體及結(jié)構(gòu)

A箱體及開(kāi)窗：菌種加入口（5）、通風(fēng)窗（6）、檢修門(mén)（9）、出料窗（16）；B物料輸入與傳出系統(tǒng)：培養(yǎng)物料輸入口（1）、微波滅菌輸送機(jī)（2）及攪拌機(jī)與冷卻區(qū)（3）、（4）、傳出帶（17）；C濕度調(diào)節(jié)系統(tǒng)：無(wú)菌儲(chǔ)水箱（7）、霧化噴霧器機(jī)構(gòu)（8）；D通氣系統(tǒng)：臭氧發(fā)生器（10）、鼓風(fēng)機(jī)（11）、臭氧輸送管（13）；E調(diào)溫系統(tǒng)：電加熱器（12）；F消毒系統(tǒng)：進(jìn)氣管（14）、空氣凈化箱（15）、紫外燈管（18）；G控制系統(tǒng)：自動(dòng)化控制管（19）、電控柜（20）；見(jiàn)圖1。

1.1.2 發(fā)酵床架系統(tǒng)

包括2個(gè)3層履帶發(fā)酵床及2個(gè)輸送帶（24/25）；見(jiàn)圖2。

圖1 發(fā)酵糟粕生產(chǎn)高活性、高營(yíng)養(yǎng)飼料的設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 發(fā)酵床結(jié)構(gòu)示意圖

1.1.3 環(huán)境調(diào)控系統(tǒng)

包括控制模塊、溫度濕度傳感器、霧化噴霧器機(jī)構(gòu)電加熱器（8）、電加熱器（12）、空氣凈化箱（15）及自動(dòng)化控制管（19），見(jiàn)圖3。

圖3 環(huán)境調(diào)控系統(tǒng)模塊結(jié)構(gòu)示意圖

1.2 制備工藝

1.2.1 工藝流程

糟粕配料→高壓滅菌→輸入發(fā)酵箱→接種菌種→攪拌混合→平鋪履帶發(fā)酵床→慢速或間歇傳動(dòng)發(fā)酵→傳出→干燥粉碎。

1.2.2 菌種制備

①液體菌種的制備（見(jiàn)表1）。

②固體菌種的制備：培養(yǎng)條件見(jiàn)表2，培養(yǎng)至真菌菌絲長(zhǎng)滿，單菌至1×1010cfu/g以上。

③復(fù)合菌種的制備：培養(yǎng)好的固體菌種或液體菌種，經(jīng)測(cè)定在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)能共同生長(zhǎng)相互協(xié)同的菌種，按食用菌或霉菌∶酵母菌∶芽孢桿菌=3～10∶1～3∶0.5～2的質(zhì)量比配混合制成復(fù)合菌種。

表1 液體菌種制備及培養(yǎng)條件

表2 固體菌種制備及培養(yǎng)條件

1.2.3 糟粕發(fā)酵

①發(fā)酵基料：?jiǎn)我换蚧旌显阍囵B(yǎng)料，餅粕加一定量的能量源來(lái)配制培養(yǎng)料。

②消毒滅菌：發(fā)酵箱清洗后用紫外線和臭氧進(jìn)行密封消毒2 h以上，新鮮無(wú)污染的發(fā)酵基料高壓滅菌后，經(jīng)微波滅菌輸送機(jī)消毒滅菌輸入發(fā)酵箱。

③接種與發(fā)酵：發(fā)酵基料一次拌入5%～20%復(fù)合固體或液體混合菌種，或先接種生長(zhǎng)慢的真菌，后接種生長(zhǎng)快的酵母菌和芽孢桿菌，攪拌均勻，時(shí)間間隔24～48 h；料厚度5～10 cm，在溫度26～37 ℃（前期低，后期高），相對(duì)濕度70%～90%條件下通氣發(fā)酵，48 h內(nèi)6～12 h翻動(dòng)1次，以后2～4 h 1次或慢速連續(xù)傳動(dòng)翻料，發(fā)酵48～96 h，待長(zhǎng)滿白色菌體為度。

1.2.4 后處理

將發(fā)酵好的糟粕經(jīng)60～85℃快速干燥后，粉碎，包裝。糟渣發(fā)酵粗蛋白質(zhì)含量25%以下，為功能性能量飼料；餅粕發(fā)酵粗蛋白含量在25%以上，為功能性蛋白飼料。

1.3 效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)

1.3.1 混合糟渣發(fā)酵飼料試驗(yàn)

① 發(fā)酵基料：用啤酒糟、白酒渣、豆渣、醬渣、醋渣按不同比例配制含粗蛋白15%的低營(yíng)養(yǎng)配方1和含粗蛋白20%的高營(yíng)養(yǎng)配方2，供發(fā)酵試驗(yàn)。

②檢測(cè)單一菌種與復(fù)合菌種發(fā)酵上述2種不同營(yíng)養(yǎng)水平的混合糟渣的營(yíng)養(yǎng)成分。

③活性物質(zhì)檢測(cè)：發(fā)酵飼料樣品加10倍水磨漿，超聲波處理10 min后，于1～4℃冰箱內(nèi)冷浸過(guò)夜，過(guò)濾取濾液，測(cè)定生物活性物質(zhì)。蛋白酶用福林酚法，淀粉酶用二硝基水楊酸法，纖維素酶用濾紙法；益生菌用稀釋平板培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)法；多糖與多肽測(cè)定分別用苯酚-硫酸法和紫外分光光度法測(cè)定。

④抗菌力測(cè)定：對(duì)上法浸提發(fā)酵飼料的水溶性物質(zhì)，用平板牛津杯法測(cè)定其對(duì)病原菌（大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、葡萄球菌等）的抑制作用（抑菌圈）。

1.3.2 餅粕發(fā)酵試驗(yàn)

棉粕、菜籽粕、茶籽餅粉碎后，分別添加10%麥麩和10%玉米粉，加水至含水量適中，121℃滅菌15 min，按10%接種組合菌種[70%食用真菌+30%復(fù)合菌（白地霉∶產(chǎn)朊假絲酵母∶枯草芽孢桿菌為2∶2∶1）]，置發(fā)酵床中，25～28 ℃，發(fā)酵2～4 d，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定棉酚（GBl3086—91）、粗蛋白（凱氏定氮法）、益生菌（計(jì)數(shù)法）、硫苷（硫脲紫外比色法）、茶皂素（香草醛-硫酸法）和氨基酸含量[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種及組合協(xié)同性研究

經(jīng)協(xié)同性測(cè)定，食用菌（平菇、鳳尾茹、白靈菇、茶樹(shù)菇、杏鮑菇、松乳菇）與飼料酵母（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母、白地霉）和芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌），小型真菌（曲霉、根霉、木霉、青霉）與芽孢桿菌共同培養(yǎng)均能良好地生長(zhǎng)，說(shuō)明食用菌與飼料酵母和芽孢桿菌、小型真菌與芽孢桿菌協(xié)同性較好。

2.2 混合糟渣發(fā)酵飼料試驗(yàn)

2.2.1 混合糟渣的營(yíng)養(yǎng)成分含量

表3 不同菌種組合發(fā)酵2種營(yíng)養(yǎng)水平的混合糟渣的營(yíng)養(yǎng)成分含量

由表3可知，根據(jù)前試驗(yàn)，選擇在槽粕培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度較快的平菇、鳳尾菇和松乳菇為主要菌種，及白地霉、假絲酵母和芽孢桿菌為輔助菌種，對(duì)高、低營(yíng)養(yǎng)水平的兩個(gè)混合糟渣進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)糟渣的飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)有很大的改善，蛋白質(zhì)提高8.39%～50%和10.54%～32.37%，粗纖維含量降低率最高達(dá)16.84%和16.59%，總能量保持不變或稍有減少（少量減少主要是脂肪含量下降所致）。結(jié)果顯示，食用菌對(duì)粗纖維的降解起主要作用，特別是平菇的降解作用最強(qiáng)，其次是鳳尾菇；白地霉、假絲酵母和芽孢桿菌對(duì)粗蛋白的提高起主要作用。綜合效果以平菇與白地霉、假絲酵母、芽孢桿菌組合效果最好，其次是鳳尾菇組合。

2.2.2 混合糟渣的活性物質(zhì)含量與抗菌力測(cè)定

表4 混合發(fā)酵糟渣的活性物質(zhì)含量

表5 混合發(fā)酵糟渣對(duì)病原菌的抑制作用（cm）

由表4和表5可知，發(fā)酵后的糟渣含有豐富的酶類、益生菌及活性多糖多肽，并具一定的抗病菌活性，其抗病菌性能主要是枯草芽孢桿菌和大型真菌多糖、多肽的作用；其酶類系各發(fā)酵菌所分泌；未發(fā)酵的混合糟渣沒(méi)有菌的培養(yǎng)，所以無(wú)活性酶與益生菌等活性物質(zhì)，亦無(wú)抗病菌活性。

2.3 餅粕發(fā)酵試驗(yàn)

2.3.1 棉粕發(fā)酵試驗(yàn)

表6 不同菌種組合發(fā)酵棉粕后棉酚和粗蛋白含量變化

從表6可見(jiàn)，松乳菇和羊肚菌發(fā)酵效果最好，尤其是與酵母菌、益生菌聯(lián)合發(fā)酵，棉酚含量分別降低85.80%和76.40%，蛋白質(zhì)含量分別提高8.64%和5.51%，其次鳳尾菇對(duì)蛋白含量的提高較好。

表7 發(fā)酵棉粕中益生菌含量及抑制病原菌活性測(cè)定

從表7可見(jiàn)，棉粕經(jīng)食（藥）用真菌與復(fù)合菌聯(lián)合發(fā)酵后，2種益生菌含量均達(dá)107cfu/g以上，尤其是松乳菇和羊肚菌聯(lián)合益生菌發(fā)酵效果好；同時(shí)結(jié)果顯示，發(fā)酵料對(duì)病原菌有良好的抑制效果。

2.3.2 菜籽粕發(fā)酵試驗(yàn)

由表8可知，根據(jù)菌種篩選實(shí)驗(yàn)，選擇能在菜籽粕培養(yǎng)基上較好生長(zhǎng)的松乳茹作為發(fā)酵菌，松乳菇和松乳菇組合益生菌發(fā)酵菜籽粕硫苷的降解率分別為52.04%和65.36%，粗蛋白提高4.93%和6.01%。

2.3.3 茶籽餅發(fā)酵試驗(yàn)

表8 菜籽粕發(fā)酵后硫苷與粗蛋白含量變化

由表9可知，3種食用真菌及其菌種組合發(fā)酵茶籽餅，3種食真菌對(duì)茶皂素的降解率為茶樹(shù)菇＞羊肚菌＞松乳菇，食用菌與復(fù)合益生菌組合發(fā)酵進(jìn)一步提高茶皂素的降解率，茶樹(shù)菇與復(fù)合菌組合發(fā)酵茶皂素的降解率達(dá)65.44%；對(duì)粗蛋白含量提高率為：松乳菇＞羊肚菌＞茶樹(shù)菇，食用菌與復(fù)合益生菌組合發(fā)酵粗蛋白含量進(jìn)一步提高，尤其是羊肚菌與復(fù)合益生菌組合發(fā)酵，粗蛋白含量較羊肚菌單獨(dú)發(fā)酵提高1倍多（62.81/26.46）。

2.3.4 餅粕發(fā)酵氨基酸含量變化

由表10可知，三種餅粕經(jīng)發(fā)酵后，總氨基酸含量隨蛋白含量的提高而增加，且食用菌+復(fù)合益生菌發(fā)酵比單獨(dú)食用菌發(fā)酵氨基酸的含量高；棉粕氨基酸含量最多提高13.54%（羊肚菌+復(fù)合菌）；菜粕最多的提高1.30%（松乳菇+復(fù)合菌）；茶籽餅提高幅度最大的達(dá)22.02%（羊肚菌+復(fù)合菌）。相比總氨基酸，必需氨基酸總含量的提升幅度更大，約為總氨基酸提高幅度的2倍。各種必需氨基酸的提高幅度：棉粕以羊肚菌、羊肚菌與復(fù)合益生菌發(fā)酵提高幅度最大，其中蘇氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和精氨酸均提高20%以上；發(fā)酵菜籽粕主要是蛋氨酸提高最多，達(dá)15.74%；羊肚菌及其組合發(fā)酵茶籽餅幾種必氨基提高14.71%～66.78%。半必需氨基酸如精氨酸含量亦有較大幅度的提高，發(fā)酵棉粕和發(fā)酵菜籽粕最大提高率分別達(dá)32.17%和10.80%。由此可見(jiàn)餅粕發(fā)酵后，氨基酸的組成發(fā)生明顯的改善，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)得到明顯提升。

表9 茶籽餅發(fā)酵后茶皂素與粗蛋白含量變化

表10 餅粕發(fā)酵后氨基酸含量變化(%)

表10（續(xù)） 餅粕發(fā)酵后氨基酸含量變化(%)

3 討論

目前飼料生物發(fā)酵劑由于菌種特性的局限性（如乳酸菌產(chǎn)酸過(guò)高、釀酒酵母產(chǎn)酒精過(guò)高、芽孢菌生物酶活力低、霉菌發(fā)酵易混雜黃曲霉等有害菌）或者菌種之間的組合配比不合適等[11-12]，在發(fā)酵糟渣的過(guò)程中，除了形成較多的活性益生菌、有機(jī)酸、醇和生物酶外，對(duì)餅粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子也有一定的降解，但對(duì)糟粕中的大分子物質(zhì)，尤其是纖維素降解率很低，不利單胃動(dòng)物消化；同時(shí)，發(fā)酵溫度高（35℃以上），能量損失大；還易于受雜菌（尤其是有害霉菌和腐敗菌）污染，飼料霉?fàn)€變質(zhì)，引起動(dòng)物中毒。如果發(fā)酵飼料鮮飼常出現(xiàn)因乳酸菌等產(chǎn)有機(jī)酸過(guò)多，造成動(dòng)物體酸堿失衡；或釀酒酵母產(chǎn)酒精的濃度大，導(dǎo)致動(dòng)物酒精中毒。如果發(fā)酵料經(jīng)干燥制成飼料原料，在干燥過(guò)程中大量的低分子有機(jī)酸、醇等揮發(fā)性物質(zhì)隨熱揮發(fā)掉，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是能量的嚴(yán)重?fù)p失[13]。本文采用不同組合菌種對(duì)糟粕進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵充分，纖維降解率高，蛋白提高率大，活性物質(zhì)含量高，能量損失少。同時(shí)氨基酸的組成得到改善，必需氨基酸含量增加，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)得到明顯提升。

在生物發(fā)酵飼料的生產(chǎn)工藝中，一是采用厭氧發(fā)酵工藝，即用乳酸菌、芽孢桿菌、酵母等厭氧或兼性厭氧菌種，將糟粕置密封容器中發(fā)酵；與有氧發(fā)酵比，生物反應(yīng)慢，效率低，發(fā)酵的效果差。二是用霉菌等需氧菌，將糟粕置敞開(kāi)的發(fā)酵床或發(fā)酵池中進(jìn)行通氣式發(fā)酵，其發(fā)酵效率可大大提高，但條件難以控制，易雜菌污染，效果不穩(wěn)定。三是先用需氧菌進(jìn)行短時(shí)間的有氧發(fā)酵，再用厭氧菌進(jìn)行二次厭氧發(fā)酵；但因工藝復(fù)雜，在生產(chǎn)中應(yīng)用較少。

本文設(shè)計(jì)的固體發(fā)酵設(shè)備，根據(jù)發(fā)酵菌種，特別是食用真菌菌絲需氧充足而不宜多翻攪的特點(diǎn)，采取“雙列層架循環(huán)履帶循環(huán)式發(fā)酵箱（發(fā)酵床機(jī)構(gòu)）”（亦可據(jù)此原理設(shè)計(jì)為多列），自動(dòng)控溫調(diào)濕；紫外、臭氧相結(jié)合的室內(nèi)殺菌消毒和外接微波或蒸汽高溫物料消毒殺菌，使雜菌繁殖降低到最低限度，保障有益菌的充分繁殖與發(fā)酵；配備熱風(fēng)/冷風(fēng)供給裝置，及內(nèi)設(shè)噴霧裝置，自動(dòng)通風(fēng)、控溫、調(diào)濕，保障固態(tài)發(fā)酵的環(huán)境；履帶輸送系統(tǒng)使預(yù)處理的基料自動(dòng)輸入，通過(guò)攪拌器與菌種混合，履帶自調(diào)定時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)或低速連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)翻料與傳送，發(fā)酵后可自動(dòng)傳出，可連續(xù)發(fā)酵，也可批次發(fā)酵。該設(shè)備滿足工藝要求，內(nèi)部環(huán)境條件控制良好（解決固體生物發(fā)酵溫度、濕度與供氧控制難及真菌菌絲體不宜攪動(dòng)的技術(shù)瓶頸），具有低能耗的消毒殺菌系統(tǒng)，能滿足生產(chǎn)的要求，整體設(shè)備自動(dòng)化程度高。

4 結(jié)論

本裝置溫、濕、氣自動(dòng)調(diào)控，生產(chǎn)能耗低。發(fā)酵效果試驗(yàn)結(jié)果表明，使用該設(shè)備，糟粕發(fā)酵充分，營(yíng)養(yǎng)抑制因子降解率高，蛋白提高率大，活性物質(zhì)含量高，能量損失少。適宜于大規(guī)模生產(chǎn)，省工省時(shí)，效率高。