正常細(xì)胞受饑餓、衰老和蛋白錯誤折疊或聚集等因素的誘發(fā),為應(yīng)對胞內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激變化,維持自身穩(wěn)定,細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象[1]。然而,當(dāng)自噬(autophagy)的水平超過細(xì)胞所能承受的限度,則會引起細(xì)胞過度損傷甚至死亡。通常,陳舊蛋白及受損細(xì)胞器主要通過自噬降解,而短時作用蛋白則通過泛素-蛋白酶體途徑降解,二者共同維持細(xì)胞存活[2]。隨著對細(xì)胞自噬認(rèn)知的不斷提高,自噬的生物學(xué)作用與損傷神經(jīng)元功能修復(fù)方面的聯(lián)系逐漸顯現(xiàn)出來,自噬與腦中風(fēng)的康復(fù)治療隨即受到基礎(chǔ)或臨床醫(yī)學(xué)的普遍關(guān)注。
腦中風(fēng)是一種由腦組織缺血及出血導(dǎo)致的以神經(jīng)功能缺陷為主要臨床表現(xiàn)的急性腦血管病。該疾病具有三大特征:發(fā)病率高、致殘率高和死亡率高。據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明,我國每年有約800萬腦中風(fēng)新發(fā)病人,年死亡人數(shù)超過200萬,且年增長速率高達(dá)8.7%,其中約70%的病人因為腦中風(fēng)造成神經(jīng)功能嚴(yán)重缺陷不能獨立生活,嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量,加重家庭和社會負(fù)擔(dān)[3]。在腦中風(fēng)病人中,約80%為缺血性腦中風(fēng),又稱缺血性腦損傷。當(dāng)前僅有纖維組織酶原激活劑(tissue plasmagrn activator,tPA)為有效的治療藥物,但僅3 h的給藥時間窗及嚴(yán)重的副作用如出血等,極大地限制了tPA的廣泛應(yīng)用[4]。此外很多在動物實驗中找到的神經(jīng)保護(hù)藥物在臨床上均未獲得理想的效果,顯示出嚴(yán)重的毒副作用。最近研究顯示,自噬是一種可逆性的細(xì)胞死亡,通過針對自噬的藥物治療可明顯提高腦中風(fēng)梗死半影區(qū)的細(xì)胞存活,并可顯著改善腦中風(fēng)后的神經(jīng)功能恢復(fù)。因此深入探究自噬對缺血半影區(qū)損傷神經(jīng)元的修復(fù)作用及其調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而尋求有效的神經(jīng)保護(hù)方案顯得尤為重要。本文重點討論自噬對神經(jīng)元存活的影響,以及自噬在腦中風(fēng)后的神經(jīng)保護(hù)及神經(jīng)損傷作用。并討論干預(yù)自噬提高腦中風(fēng)后神經(jīng)保護(hù)的可能機(jī)制,為研究自噬在腦中風(fēng)后的病理及藥理機(jī)制提供參考。
自噬即指細(xì)胞的自我吞噬,是細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)外界環(huán)境應(yīng)激變化而引發(fā)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。在不同的條件下,自噬可發(fā)揮不同的效應(yīng)。一方面,細(xì)胞通過自噬降解細(xì)胞陳舊蛋白質(zhì)、損傷細(xì)胞器等實現(xiàn)自我更新,同時釋放氨基酸和三磷酸腺苷(ATP)等緩解組織內(nèi)的能量供應(yīng)短缺,提高損傷細(xì)胞的存活率。另一方面,當(dāng)自噬過度激活或自噬不足時,則引發(fā)自噬應(yīng)激,破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài),擾亂細(xì)胞的正常代謝,導(dǎo)致細(xì)胞器損傷,如觸發(fā)線粒體死亡途徑等,引起自噬性細(xì)胞死亡,即Ⅱ型程序型細(xì)胞死亡(programmed cell death,PCD),對細(xì)胞有害,并參與多種疾病的致病過程[5],與另一種Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡有所區(qū)別,所以說自噬在疾病中有雙重作用。
1.1 自噬的分類 按照生理功能和細(xì)胞內(nèi)底物運送至溶酶體內(nèi)被降解方式的差異,可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperon-mediated autophagy,CMA)。巨自噬是指雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體(autophagosome)先包裹細(xì)胞需要降解的廢棄物,并通過與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體(autolysosome),而后溶酶體酶使物質(zhì)循環(huán)再利用。在生理狀態(tài)下,巨自噬已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中具有保護(hù)作用,是通常所指的自噬過程。微自噬是指溶酶體本身膜形變?yōu)槿苊阁w內(nèi)膜泡,直接吞噬胞質(zhì)、內(nèi)含物和細(xì)胞器的方法。CMA是指胞質(zhì)內(nèi)蛋白最初與分子伴侶如熱休克蛋白70(hot shock protein,HSP70)結(jié)合后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中,繼而被溶酶體酶消化。雖然這3種主要方式發(fā)生過程不同,但在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有共同的作用。
1.2 自噬的發(fā)生周期 具體來說自噬的產(chǎn)生周期可人為地將其分為自噬膜的誘導(dǎo)、自噬體的形成、自噬體的運輸、自噬體的降解4個階段,是一個高度調(diào)控的多步驟進(jìn)程,其中最為關(guān)鍵是自噬體的形成。①自噬膜的誘導(dǎo):在饑餓、缺血缺氧和生長因子缺乏等上游信號的刺激下,自噬前體由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體參與包裹降解物而形成。通過識別機(jī)制的不同將這一階段分為有選擇性和非選擇性兩種自噬,前者由細(xì)胞內(nèi)的底物誘導(dǎo)發(fā)生,而后者由細(xì)胞外的刺激發(fā)生。②自噬體的形成:分隔膜經(jīng)過延伸和彎曲構(gòu)成 “C”形至“O”形的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體,其直徑一般在500 nm左右,此過程受微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)和自噬相關(guān)基因5-12兩種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的調(diào)控。③自噬體的運輸:自噬體通過自身的運輸與溶酶體結(jié)合形成單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體。④自噬體的降解:通過溶酶體中的酶消化分解,使自噬體膜分離,并且將有用的產(chǎn)物如氨基酸、核苷酸等輸送到胞漿中循環(huán)利用。
細(xì)胞自噬不同于壞死和凋亡,它可以讓細(xì)胞獲得再生的機(jī)會。由于大部分神經(jīng)細(xì)胞不能分裂,對于神經(jīng)元這類不可再生的細(xì)胞來說,這個過程尤為重要,多數(shù)細(xì)胞器的更新依賴于自噬機(jī)制。分化完全的神經(jīng)細(xì)胞,想要通過其他方式來恢復(fù)自身功能幾乎是不可能的,倘若自噬相關(guān)基因發(fā)生突變則細(xì)胞必將受損直至死亡。例如將小鼠的自噬相關(guān)基因Atg5敲除,可導(dǎo)致大量蛋白聚集在神經(jīng)元,自噬功能異常,出生后的幾小時內(nèi)小鼠便死亡[6]。此外,神經(jīng)細(xì)胞自噬不僅實現(xiàn)自我消化,而且也為周圍細(xì)胞提供原料,使細(xì)胞對抗外界不利因素的適應(yīng)能力大大提高。研究表明,自噬功能缺失與缺血性疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、炎癥和免疫性疾病密切相關(guān)。
3.1 自噬的檢測 累積的證據(jù)表明,缺血性刺激后,自噬在腦組織或神經(jīng)細(xì)胞中被激活。主要通過電子顯微鏡觀察法、免疫印跡、免疫組化、免疫熒光檢測,從形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)等方面提供單個或組合的實驗證據(jù)。
自噬的檢測方法分為直接法和間接法兩種形式,前者在于觀察自噬的形態(tài),后者則是檢測自噬表達(dá)的特征蛋白。1995年,Nikoletopoulou等首次通過電子顯微鏡觀察到雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的沙土鼠大腦海馬CA1區(qū)的自噬現(xiàn)象[7]。直到現(xiàn)在,準(zhǔn)確地對自噬體進(jìn)行定位、定性甚至定量檢測,一直是檢測自噬的金指標(biāo)。MAP1-LC3 是酵母菌自噬基因(Atg7/Atg8)在哺乳動物中的同源物,作為自噬體形成的標(biāo)志性蛋白,其在組織中以胞漿型(LC3-Ⅰ)和膜型(LC3-Ⅱ)兩種形式存在,因此,想要觀察自噬水平的增強(qiáng)和減弱可采用Western Blot 技術(shù)分析LC3-Ⅱ/Ⅰ的灰度值[8]。Beclin1 是另一種檢測自噬的起始標(biāo)志物,這種自噬相關(guān)蛋白與酵母中Atg6同源。不同的是P62蛋白在自噬過程作為負(fù)調(diào)節(jié)因子,也都在研究缺血性腦中風(fēng)中作為自噬的常用指標(biāo)。除此之外,還有單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverin,MDC)染色法、吖啶橙(acridineorange,AO)染色法和熒光顯微鏡法,是基于自噬原理的特殊染色方法。
3.2 自噬的調(diào)控 細(xì)胞在正常情況下,自噬的表達(dá)水平較低,然而當(dāng)神經(jīng)元受到過多的外界刺激,就使得基礎(chǔ)自噬轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)自噬[9]。而在缺血性腦卒中的研究中自噬的誘導(dǎo)常常需要加入自噬的抑制劑和激活劑作為實驗的對比驗證。
主要影響自噬的調(diào)控機(jī)制大致分為磷酸肌醇三磷酸激酶(PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,TOR)、GAI3 蛋白和氨基酸、激素等[10]。這其中Ⅰ型PI3K和哺乳動物TOR(mTOR)作為抑制自噬信號的通路,而PI3K通路的Ⅲ型則作為激活自噬信號的通路。3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)、渥漫青霉素(Wortmannin,WM)和LY294002是研究者普遍使用的自噬抑制劑,它們都可以阻止或影響自噬體的形成,這其中最為理想的抑制效果是3-甲基腺嘌呤,作為Ⅲ型PI3K通路的抑制劑。值得關(guān)注的是,有研究表明,3-MA對自噬具有雙重作用,在營養(yǎng)充足下,3-MA能促進(jìn)自噬的發(fā)生,而在細(xì)胞饑餓條件下抑制自噬的發(fā)生[11]。巴伐洛霉素A1(Bafilomycin A1)和長春堿用于阻斷自噬體與溶酶體的融合,E64d作為蛋白酶抑制劑則參與抑制溶酶體的降解。雷帕霉素(rapamycin,RAP)是mTOR的抑制劑,有助于Atg13的去磷酸化和其他自噬相關(guān)基因的活化,促進(jìn)自噬的發(fā)生,是一種廣泛應(yīng)用的自噬激活劑[12]。
在大量缺血性腦中風(fēng)動物模型中發(fā)現(xiàn),腦缺血可顯著激活細(xì)胞的自噬活性,并可通過藥物干預(yù)調(diào)節(jié)。由于自噬在缺血性腦中風(fēng)后受細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度、缺血時間長短和缺血腦區(qū)部位等多種因素的影響,自噬在腦中風(fēng)后的作用效應(yīng)不盡相同,甚至截然相反。通過檢索新近文獻(xiàn),自噬在腦中風(fēng)后的作用歸納如下。
4.1自噬在缺血性腦中風(fēng)的保護(hù)作用 在腦缺血發(fā)生的早期,為應(yīng)對神經(jīng)元的損傷,自噬體運載其內(nèi)容物從軸突運輸至胞體,與溶酶體融合后,清除受損神經(jīng)細(xì)胞,保護(hù)周圍的神經(jīng)細(xì)胞,維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),自噬被稱為神經(jīng)元的“管家”,輕度或中度激活自噬可提高神經(jīng)細(xì)胞生存[13]。Jiang等[14]在大鼠永久性缺血前進(jìn)行缺血預(yù)處理,當(dāng)加入用載體化合物C(AMPK抑制劑)或自噬抑制劑3-MA后,腦梗死體積增加,神經(jīng)損傷嚴(yán)重,表明提高自噬有助于缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)保護(hù)。Zhou等[15]分別建立了大鼠局灶性腦缺血體內(nèi)動物模型和氧糖剝奪(OGD)體外細(xì)胞模型。通過腹腔注射自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素增強(qiáng)自噬,結(jié)果顯示,腦梗死體積、腦組織中丙二醛、過氧化物歧化酶和細(xì)胞色素C水平顯著下降。相反,海馬神經(jīng)元OGD 模型用3-MA 抑制自噬后,原代海馬神經(jīng)元損傷明顯加重。由此推測,自噬對缺血性腦中風(fēng)具有神經(jīng)保護(hù)作用。Wei等[16]建立小鼠大腦中動脈誘導(dǎo)的缺血性腦中風(fēng)實驗說明,神經(jīng)元特異性常規(guī)蛋白激酶C(cPKC)γ通過Akt-mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬的升高,改善了缺血性腦卒中后小鼠的神經(jīng)學(xué)結(jié)果。Yan 等[17]實驗得出高壓氧預(yù)適應(yīng)與自噬激動劑雷帕霉素具有相似的功能, LC3-Ⅱ以及Beclin1 的自噬蛋白表達(dá)升高后腦損傷減少,3-甲基腺嘌呤抑制自噬后,腦損傷則加劇。值得關(guān)注的是,另有研究發(fā)現(xiàn),雷帕霉素在腦缺血的初期保護(hù)作用顯著,但在腦缺血末期其保護(hù)效果顯著降低[18]。
4.2 自噬在缺血性腦中風(fēng)的損傷作用 但也有研究者提出相反的結(jié)論,在營養(yǎng)匱乏、毒性刺激和低氧等應(yīng)激因素的刺激下,細(xì)胞的自噬活性明顯增強(qiáng),當(dāng)超過細(xì)胞所能承受的范圍時,眾多的自噬底物在軸突中積聚,迫使溶酶體逆向轉(zhuǎn)運至軸突,從而使軸突運輸功能紊亂,最后導(dǎo)致神經(jīng)元受損,因此過度的激活自噬促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞大量死亡[9]。Dong等[19]用Nissl染色顯示,接受Ro25-6981治療的大鼠海馬CA1錐體層神經(jīng)元損傷減少,降低雷帕霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和缺血再灌注后自噬的過度激活,對神經(jīng)元有保護(hù)作用。Wang等[20]研究建立了大鼠遠(yuǎn)端缺血期處理和缺血后處理結(jié)合模型,通過抑制自噬減弱了血漿HMGB1水平,腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用明顯,而加入自噬激活劑雷帕霉素?fù)p傷增強(qiáng)。Yang等[21]通過永久性大腦中動脈閉塞(pMCAO)在小鼠中構(gòu)建了局灶性腦缺血模型,檢測到體內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的自體吞噬和炎癥反應(yīng),使用藥物抑制劑3-MA抑制自噬不僅降低了小膠質(zhì)細(xì)胞的自噬和炎癥反應(yīng),而且降低了腦梗死面積,減少了水腫形成和神經(jīng)缺陷,表明腦缺血誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬增強(qiáng)缺血性神經(jīng)炎癥和損傷。Luo等[22]用右旋美托咪啶(dexmedetomidine,DEX)和3-MA后處理對于用雷帕霉素處理的短暫動脈閉塞(tMCAO)模型相比較,抑制缺血周圍腦組織的神經(jīng)元自噬可以減少腦梗死面積并改善神經(jīng)功能缺陷,增加氧糖剝奪模型中原代培養(yǎng)神經(jīng)元的活力和凋亡,這表明在再灌注開始時抑制神經(jīng)元自噬,可以保護(hù)小鼠腦免受缺血再灌注損傷,有助于提高受損神經(jīng)元的存活。
4.3 自噬和缺血性腦中風(fēng)相關(guān)研究的總結(jié)分析 越來越多的研究證實,自噬在缺血性腦中風(fēng)后的作用十分顯著。而在腦缺血前進(jìn)行缺血預(yù)適應(yīng)可挽救自噬造成的腦缺血損傷,其與缺血性腦卒中自噬發(fā)生的時間及程度有所區(qū)別。盡管目前關(guān)于腦缺血后自噬對神經(jīng)元是保護(hù)還是損傷仍然眾說紛紜,其可能存在的機(jī)制包括:以降解神經(jīng)突觸為神經(jīng)元提供能量;降解受損的線粒體從而抑制凋亡發(fā)生;降解能量消耗來緩解細(xì)胞死亡[23]。但可以確定的是在腦缺血的初期,自噬的激活是對外界環(huán)境變化的一種適應(yīng)性反應(yīng),并作為一種防御機(jī)制;而隨著自噬的增加,如在腦缺血的末期,神經(jīng)元損傷則以凋亡和壞死為主,原因在于自噬的保護(hù)作用及損傷作用在不同條件下可能會相互轉(zhuǎn)化。使用化學(xué)藥劑對自噬的非特異性和單一方法監(jiān)測動物腦缺血模型自噬的可靠性等都會造成實驗結(jié)果的不一致,使得必須避免動物模型個體差異的影響,設(shè)計多個監(jiān)測時間點[24]。 Sadoshima 等[25]歸納總結(jié):適度自噬可可提高缺血性腦中風(fēng)后的神經(jīng)保護(hù)作用,而過度自噬加劇缺血性腦中風(fēng)的神經(jīng)損傷。
自噬參與多種生理和病理過程。雖然自噬在缺血性腦中風(fēng)的確切作用還存在爭議,但可以確定的是,自噬可調(diào)節(jié)腦缺血半影區(qū)損傷神經(jīng)元死亡和存活之間的平衡,在損傷神經(jīng)元的命運轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但清楚認(rèn)識自噬發(fā)生的相關(guān)調(diào)節(jié)因素及信號通路,腦缺血時自噬與凋亡、壞死之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系及作用,以及藥物對腦缺血的有效治療方法還有待進(jìn)一步研究,更加深入全面地認(rèn)識自噬與缺血性腦中風(fēng)的關(guān)系,以及相關(guān)的病理及藥理機(jī)制,為腦中風(fēng)的臨床治療提供重要的研究基礎(chǔ)及可行性線索。