陳天翔 楊運海

肺癌是我國乃至世界發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤之一[1]。大約85%的肺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），早期NSCLC經(jīng)手術治療5年生存率可達70%-90%[2]，但是約75%的患者在初診時已是進展期或晚期[3]。小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）在肺癌中僅占15%左右，但是SCLC更具侵襲性，超過90%的患者在診斷時已是晚期[3]，5年生存率僅為5%。晚期肺癌是肺癌治療的主要挑戰(zhàn)，近年來以表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、ROS1等為靶點的藥物均臨床上展現(xiàn)了卓越療效，已成為僅次于化療的主要治療方式。例如，三代EGFR抑制劑奧西替尼（AZD9291）的中位無進展生存期（progression-free survival, PFS）可達19.3個月[4]，二代ALK抑制劑色瑞替尼在無腦轉(zhuǎn)移患者中的PFS可超過2年[5]。但是這些抑制劑僅適用于具備該靶點的患者，而其他患者則無法從中獲益，只能選擇收效甚微的化療。因此深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找新的靶點刻不容緩。環(huán)狀RNA（circular RNA, circRNA）是一類缺少5'與3'端，由共價鍵形成閉合環(huán)狀的特殊RNA。這種特殊的環(huán)狀結構使得circRNA對核酸外切酶RNase R耐受，在胞內(nèi)的半衰期超過48 h，呈現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性[6]。此外circRNA在真核生物內(nèi)含量豐富，表達具有組織特異性與疾病特異性，同時參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，有望成為腫瘤的生物標記物與治療靶點。

1 CircRNA在肺癌中的表達及意義

1.1 CircRNA的診斷價值 提高早期診斷率是改善肺癌生存率的關鍵。目前關于肺癌分子標記物的研究主要集中在腫瘤循環(huán)細胞、循環(huán)DNA、循環(huán)miRNA、血清腫瘤標志物、肺癌自身抗體等，前三種標記物在早期肺癌的血液含量極為有限，敏感性不足，后兩種標記物的敏感性與特異性均不理想[7]，而circRNA的出現(xiàn)則為肺癌的早期診斷帶來了新的希望。Zhu等[8]利用circRNA芯片技術在肺腺癌患者腫瘤組織中鑒定出39個異常表達的circRNA，經(jīng)驗證后發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0013958在細胞株、組織及血漿中均高表達。且發(fā)現(xiàn)組織hsa_circ_0013958的表達與原發(fā)灶-淋巴結-遠處轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期、淋巴結轉(zhuǎn)移相關。以健康人群為對照，血漿與組織hsa_circ_0013958的受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線下面積（area under the curve, AUC）分別為0.794與0.815。隨后研究人員對hsa_circ_0013958在不同分期肺腺癌的AUC分別進行了評價，發(fā)現(xiàn)組織hsa_circ_0013958在早期肺腺癌的診斷中依舊表現(xiàn)優(yōu)良，其在I期與II期的AUC依次為0.75、0.766。Hang等[9]利用RNA-seq結合qRTPCR驗證，發(fā)現(xiàn)circFARSA在NSCLC患者血漿中表達上調(diào)，并與腫瘤組織中circFARSA的表達呈線性相關，而FARSA的mRNA在血漿中無法檢測出。以健康人群為對照，血漿circFARSA具有一定的診斷價值，AUC為0.71。CircRNA_102231與hsa_circ_0000729在肺腺癌組織中均異常高表達，并與TNM分期、轉(zhuǎn)移相關，circRNA_102231的AUC為0.897，敏感性與特異性分別為0.812、0.887，hsa_circ_0000729的AUC為0.815[10,11]。此外，Tan等[12]發(fā)現(xiàn)EML4-ALK融合可表達融合circRNA（F-circEA），而F-circEA僅特異性地表達于EML4-ALK陽性患者的血漿內(nèi)，提示F-circEA有望開發(fā)為EML4-ALK陽性的診斷標記物。

1.2 CircRNA的預后價值 預后評價是制定臨床方案的重要參考項，對于延長患者生存期意義重大。Zou等[13]發(fā)現(xiàn)circ-0067934在NSCLC腫瘤組織及細胞株內(nèi)均顯著高表達。Kaplan-Meier生存與對數(shù)秩檢驗分析表明circ-0067934高表達與總體生存期負相關，Cox比例風險分析指出circ-0067934可作為NSCLC患者不良預后判斷的獨立風險因子。CiRS-7作為超級海綿，在肺癌中的預后價值也有一定的研究。Su等[14]分別檢測了128例NSCLC患者腫瘤組織標本發(fā)現(xiàn)ciRS-7異常上調(diào)，miR-7異常下調(diào)。而高表達ciRS-7、低表達miR-7的NSCLC患者往往較為晚期，一般瘤體較大，伴有淋巴結轉(zhuǎn)移，生存期較短，作者認為高表達ciRS-7與低表達miR-7均是患者不良預后的獨立預測因子。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)circ_0001649在NSCLC腫瘤組織中表達下調(diào)，其表達與TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、預后相關。Hsa_circRNA_000122在肺鱗癌中表達下調(diào)，低表達hsa_circRNA_000122的患者總體生存期顯著縮短，有望開發(fā)為肺鱗癌的預后標記物[16]。

2 CircRNA在肺癌進展中的作用及機制

與大多數(shù)腫瘤一樣，肺癌在發(fā)生發(fā)展中亦表現(xiàn)出惡性增殖、凋亡抵制、侵襲增強以及無法避免的耐藥性。CircRNA雖然在肺癌中異常表達，并與TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移相關，但是circRNA是否參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展呢？

2.1 促進肺癌增殖 Hsa_circ_0013958在肺腺癌中異常高表達，敲除hsa_circ_0013958可以抑制細胞的增殖[8]。Zhu等[17]首先利用原位雜交對hsa_circ_0013958進行定位分析，發(fā)現(xiàn)其主要分布在胞漿，作者推測其可能作為miRNA海綿進而促進增殖。隨后利用CIRCBASE以及STARBASE數(shù)據(jù)庫對hsa_circ_0013958可能結合的miRNA進行預測。使用熒光素酶報告基因系統(tǒng)進一步驗證，鑒定出了miR-134-5p。此外，過表達hsa_circ_0013958可以增加細胞周期D1的表達，而同時過表達miR-134可抑制其表達，提示hsa_circ_0013958可作為miR-134的海綿，上調(diào)細胞周期D1的表達進而促進細胞增殖。CircPVT1在NSCLC患者的組織及血清中均過度表達，敲除circPVT1可以抑制細胞增殖、阻滯細胞周期于G0期/G1期。通路報告芯片檢測發(fā)現(xiàn)敲除circPVT1后，E2F通路發(fā)生了最顯著的抑制，同時過表達E2F2可以逆轉(zhuǎn)circPVT1沉默后的細胞生存抑制。E2F2是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，可以通過啟動子區(qū)的E2識別位點與DPDP1多肽共結合于DNA，推進包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的細胞周期、促進其惡性增殖。數(shù)據(jù)庫預測及熒光素酶報告系統(tǒng)證明miR-125b與circPVT1、E2F2發(fā)生靶向結合，沉默circPVT1將促進miR-125b與E2F2的結合，抑制NSCLC細胞增殖。在體內(nèi)敲除circPVT1抑制了瘤體的生長與轉(zhuǎn)移，以上均提示circPVT1有望開發(fā)為NSCLC治療的靶點。此外，Chen等[18]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_100395通過miR-1228/TCF21信號軸推進細胞周期、促進肺癌細胞增殖。Circ-PUM1可作為miR-326的海綿，增加細胞周期D1的表達，促進肺腺癌細胞的增殖[19]。

2.2 抑制肺癌凋亡 Yu等[20]發(fā)現(xiàn)circHIPK3在肺癌細胞中表達增加，沉默circHIPK3顯著抑制細胞的生存，并誘導其凋亡。為找到circHIPK3在肺癌中可能結合的miRNA，Yu等[20]在沉默了circHIPK3的細胞中分別干擾三個備選miRNA，發(fā)現(xiàn)僅有轉(zhuǎn)染了miR-124抑制劑的細胞發(fā)生了表型的逆轉(zhuǎn)。此外，沉默circHIPK3可抑制miR-124靶基因SphK1、STAT3及CDK4的表達，抑制miR-124可增加這些靶基因的表達，提示circHIPK3通過miR-124-SphK1/STAT3/CDK4信號軸傳遞凋亡抵制信號，從而促進肺癌的惡性進展，為NSCLC的治療提供了新的策略。CircUBAP2與hsa_circ_0000064在肺癌組織中均表達增加，分別沉默這兩種circRNA后均可以抑制細胞增殖、促進凋亡[21,22]。沉默circUBAP2可以抑制Bcl-2、Survivin的表達，并上調(diào)Bax的表達，同時JNK、ERK1/2的活性也被抑制，提示circUBAP2可能通過干預JNK與ERK1/2通路促進細胞的凋亡。熒光素酶報告基因分析miR-339-5p、miR-96-3p與miR-135b-3p均可以與circUBAP2結合，但這些miRNA是否可以調(diào)控circUBAP2抑制凋亡的作用并不清楚。沉默hsa_circ_0000064后，Caspase-3、Caspase-9、Bax表達增加，bcl-2表達減少，關于hsa_circ_0000064與凋亡抑制之間的信號轉(zhuǎn)導需要更多的研究。

2.3 促進肺癌的轉(zhuǎn)移 腫瘤轉(zhuǎn)移是造成癌癥患者死亡的最主要原因之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）被認為與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移的相關。目前發(fā)現(xiàn)NSCLC高表達TGF-β可以刺激NSCLC細胞自身的EMT。TIF1γ在NSCLC中低表達，敲除或下調(diào)TIF1γ可以增強TGF-β誘導的EMT作用。Wang等[23]首先在細胞中過表達TGF-β誘導EMT發(fā)生，然后進行circRNA芯片分析，并檢測發(fā)現(xiàn)TIF1γ表達減少。于是假設某些circRNA的異常表達抑制了TIF1γ表達，進而激活了TGF-β誘導的EMT。根據(jù)算法對TargetScan/miRBase以及miRanda數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)，circPTK2與TIF1γ均存在miR-429/miR-200b-3p的結合位點。熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明circPTK2與TIF1γ均可與miR-429/miR-200b-3p的直接結合。該研究發(fā)現(xiàn)circPTK2可以通過海綿miR-429/miR-200b-3p抑制TIF1γ的表達來調(diào)控NSCLC的轉(zhuǎn)移，豐富了TGF-β誘導的EMT機理。Qu等[24]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0020123在NSCLC中表達增加，并且與淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關，敲除hsa_circ_0020123可以抑制腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，過表達hsa_circ_0020123則表現(xiàn)出相反的表型。數(shù)據(jù)庫預測及熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0020123可以通過miR-144-ZEB1/EZH2軸促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。ZEB1是激活EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子，EZH2是Zeste同源增強子，可激活Notch1促進腫瘤的EMT[25]。雖然該研究并沒有檢測EMT的標志物，但是推測hsa_circ_0020123可能通過miR-144-ZEB1/EZH2軸啟動NSCLC的EMT、促進其轉(zhuǎn)移。此外，circ-0067934、hsa_circ_0079530及hsa_circ_0007534在NSCLC患者中均表達增加，與淋巴結轉(zhuǎn)移相關。分別沉默這些circRNA均可削弱細胞的遷移與侵襲能力、逆轉(zhuǎn)EMT表型，表明這三種circRNA均可通過調(diào)控EMT促進NSCLC的轉(zhuǎn)移[13,26,27]。

2.4 誘導肺癌耐藥 雖然現(xiàn)有靶向藥物在肺癌的治療中表現(xiàn)良好，但是每一種藥物均會迎來耐藥，使得晚期肺癌患者陷入了無藥可用的絕境，因此深入理解耐藥機制、尋找新的靶點異常重要。Xu等[28]利用高通量circRNA芯片檢測了A549敏感株及其紫杉醇耐藥株A549/Taxol。與敏感株相比，A549/Taxol中2,909個circRNA表達顯著上調(diào)，8372個circRNA顯著下調(diào)，提示circRNA的異?？赡軈⑴c調(diào)控了紫杉醇耐藥的發(fā)生。Zhou等[29]利用circRNA芯片在HCC827敏感株及其埃克替尼耐藥株HCC827I/R中篩選出了hsa_circ_0004015。臨床樣本分析表明hsa_circ_0004015在NSCLC患者組織中表達增加，與不良生存率相關。在HCC827中過表達hsa_circ_0004015可誘導細胞對吉非替尼的耐受，在HCC827I/R中敲除hsa_circ_0004015后可增加HCC827I/R對吉非替尼的敏感性。進一步研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004015可以通過miR-1183/PDPK1軸調(diào)控細胞的耐受性。

3 討論與展望

部分circRNA在肺癌中穩(wěn)定異常表達，具有良好的靈敏度與特異性，并被證實與不良預后相關，為肺癌的早期診斷與預后標記物的開發(fā)提供了新的選擇。隨著時間的推移，將會有更多具有臨床價值的circRNA被發(fā)現(xiàn)，但是現(xiàn)有研究存在一些局限性：①研究局限于NSCLC，而circRNA在SCLC患者中的診斷/預后價值研究尚屬空白。臨床研究發(fā)現(xiàn)，I期SCLC患者經(jīng)手術切除輔助化療后5年生存率可達52%[30]，約是晚期患者5年生存率的10倍，因此通過探索SCLC中潛在circRNA標志物是提升早期診斷率的重要途徑。②主要評估了肺癌組織circRNA的表達，而血液circRNA的表達與診斷價值尚不清楚。③多數(shù)研究是基于單中心、小樣本的單個circRNA研究。肺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，現(xiàn)有的研究結果都是建立在單中心、小樣本數(shù)據(jù)基礎上，因此這些發(fā)現(xiàn)的circRNA恐怕未必能夠在多中心、大樣本數(shù)據(jù)中得到理想驗證，故針對多個circRNA構建肺癌相關的circRNA組（circRNA panel）進行研究才有機會推動circRNA真正走向臨床。

胞漿circRNA通過海綿miRNA調(diào)控肺癌的發(fā)生發(fā)展是目前機制研究的主流，而核內(nèi)circRNA在肺癌中的機制研究尚不清楚。然而大多數(shù)circRNA并不具備豐富的miRNA結合位點，對大量circRNA作為miRNA海綿提出了質(zhì)疑，同時提醒我們circRNA在肺癌中的作用機制可能不僅局限于miRNA的海綿[31]。翻譯蛋白質(zhì)，尤其是具有活性的蛋白質(zhì)，均是circRNA的重要功能，而肺癌中異常表達的circRNA或許可以通過翻譯出活性蛋白質(zhì)調(diào)控其惡性進展，這些活性蛋白是否可以成為新的靶點是未來研究一個重要方向。此外，在circRNA調(diào)控肺癌進展的機制研究中，均以單一的腫瘤細胞為對象，而腫瘤微環(huán)境中的circRNA是否異常表達，微環(huán)境中不同細胞中的circRNA是否異常表達，以及這些circRNA是否可以在不同細胞中傳遞進而促進腫瘤進展均不清楚。腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生發(fā)展的土壤，深入理解circRNA在腫瘤微環(huán)境中的作用機制，在腫瘤早期未成熟前進行干預是重要的研究方向。

現(xiàn)有研究提示未來circRNA在肺癌的臨床診斷，治療及預后預測中的潛在作用，而circRNA在肺癌發(fā)生發(fā)展中的已知作用機制將是研究肺癌新治療方法的潛在靶點。