農(nóng) 茜 陸文權(quán) 潘興壽 李天資 韋寶敏 杜紅蕾 黃小洧 梁 燁▲

1.廣西壯族自治區(qū)那坡縣人民醫(yī)院，廣西那坡 533999；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000

亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是甲硫氨酸（MET）在分解代謝中產(chǎn)生的活性甲基供體循環(huán)代謝重要的限速酶，MET 通過S- 腺苷甲硫氨酸（SAM），S- 腺苷同型半胱氨酸（SAH）和同型半胱氨酸（HCY）代謝途經(jīng)中提供活性甲基。目前認(rèn)為基因突變可導(dǎo)致血漿同型半胱氨酸（HCY）水平增高，加重患者腦卒中的患病風(fēng)險。為了解彝族高血壓患者M(jìn)THFR C677T 基因多態(tài)性的分布特征及其與血壓，HCY 水平的關(guān)聯(lián)性，課題組于2018 年10月隨機(jī)收取122 例彝族高血壓患者，檢測其收縮壓，舒張壓，HCY 和MTHFR C677T 基因位點(diǎn)，并與110例彝族非高血壓居民比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018 年10 月在廣西百色市那坡縣開展慢性病調(diào)查中發(fā)現(xiàn)的高血壓患者中隨機(jī)選取122 例彝族高血壓患者（高血壓組），檢測其收縮壓，舒張壓，HCY和MTHFR C677T 基因位點(diǎn)，并與110 例彝族非高血壓者（對照組）比較。高血壓組男75 例，女47 例，對照組男59 例，女51 例，兩組性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.457，P＞0.05）。高血壓組平均年齡為 （48.2±12.4）歲；對照組為（46.4±13.2）歲，兩組年齡差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.071，P＞0.05）。具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血壓測量方法 測量血壓用汞柱血壓計，受檢者取坐位右前臂測量，測量前不吸煙、飲酒、濃茶或咖啡，不作劇烈運(yùn)動，保持安靜休息≥30min。平坐5min 后行血壓測量，每例受檢者連續(xù)測量3次，每次間隔≥120s，取三次血壓計數(shù)的平均值為血壓值。平均收縮壓≥140mm Hg 或平均舒張壓≥90mm Hg 或已確診為高血壓患者[7]。

1.2.2 用于PCR 檢測的血液標(biāo)本采集與處置 （1）抗凝劑用檸檬酸抗凝液（右旋葡萄糖1.47g，檸檬酸0.48g，檸檬酸鈉1.32g，加H2O 至100mL）。采集受檢者外周靜脈血3mL，置于存有0.5mL 檸檬酸抗凝液的凍存管中，置于0℃冰箱保存40h 后轉(zhuǎn)-70℃冰箱貯存。（2）基因組DNA 提?。河肊DTA 抗凝管采集受檢者外周靜脈血3mL，置于20℃室溫2h，嚴(yán)格按照QIAamp DNA Blood Maxi 試劑盒說明書操作。

1.2.3 用于HCY 檢測的血液標(biāo)本采集與處置 受檢者禁食≥10h，于早晨6：30 ～9：30 采取坐位，用EDTA 抗凝管抽肘靜脈血5mL，以3000r/min離心10min，取血漿置-30 ℃凍存?zhèn)洳椤?用日立HITACHI 7600-020 ISE 全自動生化儀（HITACHI公司生產(chǎn)，由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司提供）循環(huán)酶法檢測血漿HCY 水平。

1.3 主要儀器與試劑

美 國Bio-Rad PTC-200 PCR 儀（Bio-Rad Laboratories公司生產(chǎn)，由天津偉思實(shí)驗(yàn)儀器科技有限公司提供），3730XL 測序分析儀和POP-7TM高分子聚合物[Applied BiosystemsTM公司生產(chǎn)，由賽默飛世爾科技（中國）有限公司提供]，Gel Doc XR+ BIO-RAD全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories 公司生產(chǎn)，上海艾研生物科技有限公司提供），超微量分光光度計NanoVue（GE Healthcare 公司，廣州市龍煜生物科技有限公司由提供），DYCP-34A 瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)，由天津偉思實(shí)驗(yàn)儀器科技有限公司提供）。ABI 3100 全自動序列分析儀（美國ABI 公司）。主要試劑：QIAamp DNA Blood Maxi 血液基因組DNA 提取試劑盒（德國QIAGEN 公司生產(chǎn)，由廣西根遼生物技術(shù)有限公司提供），Premix Ex TaqTMVersion 2.0（Loading dye mix 生產(chǎn)，廣西助研基因科技有限公司提供），Tris- 硼酸鹽-EDTA（Tris-borate-EDTA），powder（TAKARA 公司生產(chǎn)，廣西助研基因科技有限公司提供）。

1.4 基因擴(kuò)增與鑒定

基因型鑒定采用PCR-RFLP 法：參見文獻(xiàn)[8]。引物由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司合成。MTHFR C677T 的SNP 上游引物序列為5’- CCG AAG CAG GGA GCT TTG -3’，下游引物序列5’- AGG ACG GTG CGG TGA GAG TG -3’。反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，60℃退火30s， 72℃延伸45s，30 個循環(huán)擴(kuò)增，隨后72℃延伸5 min。4% 瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切結(jié)果：純合野生型C/C 僅有一條198bp 條帶；純合突變型T/T 可被酶切為175bp和23bp 2 個條帶；雜合子C/T 應(yīng)包括198bp、175bp和23bp 3 個條帶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS20.0 軟件處理，應(yīng)用HaploView 4.2軟件進(jìn)行單核甘酸多態(tài)性的Hardy-Wein-berg平衡分析。對全血和基因組DNA 的MTHFR C677T 基因型檢測方法進(jìn)行Kappa一致性檢驗(yàn)。計量資料正態(tài)或近似正態(tài)分布資料以（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)；三組間比較用方差檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)；計數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高血壓組與對照組血壓和HCY水平分布特征比較

高血壓組收縮壓，舒張壓和HCY 平均水平均高于對照組（P＜0.01）。見表1。

表3 彝族高血壓患者M(jìn)THFR C677T 不同基因位點(diǎn)與血壓和HCY水平比較

組別 分型 n 收縮壓（mm Hg） 舒張壓（mm Hg） HCY（μmol/L）高血壓組 CC 15 145.40±14.06 89.80±5.54 21.68±7.22 CT 58 148.07±17.64 92.76±9.10 23.60±8.54 TT 49 156.08±14.33 99.35±10.63 29.40±6.63 qTT組與CC組比較PTT組與CC組比較qTT組與CT組比較10.682 9.547 7.716 0.025 0.001 0.001 2.669 2.959 2.913 0.033 0.024 0.018對照組 CC 35 116.43±12.12 73.66±8.43 13.29±7.33 CT 59 117.64±14.62 74.22±8.61 15.20±8.31 TT 16 121.13±16.15 76.75±11.32 19.05±8.71 PTT組與CT組比較qTT組與CC組比較PTT組與CC組比較qTT組與CT組比較4.696 3.093 5.758 0.273 0.257 0.001 1.215 0.563 1.903 0.687 0.770 0.272高血壓組與對照組比較 tCC PTT組與CT組比較PCC tCT PCT tTT PTT 7.382 6.792 3.725 0.000 0.000 0.002 6.336 6.861 3.249 0.000 0.000 0.003 27.958 6.584 4.111 0.000 0.000 0.000

2.2 高血壓組與對照組MTHFR C677T基因位點(diǎn)CC、CT、TT型頻率和等位基因頻率分布比較

高血壓組MTHFR C677T 基因位點(diǎn)TT 型頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高血壓組MTHFR C677T 位點(diǎn)T 等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 高血壓組與對照組MTHFR C677T基因位點(diǎn)不同類型與血壓和HCY水平比較

在高血壓組中，TT 型患者收縮壓平均水平高于CC型，也高于CT型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TT 型患者舒張壓平均水平高于CC 型，也高于CT型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在對照組中，CC、CT 和TT 三組收縮壓和舒張壓平均水平， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在高血壓組中，TT 型的HCY 平均水平高于CC 型，也高于CT 型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在對照組中TT 型的HCY 平均水平高于CC 型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組CT 與CC 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

3 討論

本地區(qū)的社會經(jīng)濟(jì)正在步入高速發(fā)展的勢頭，不斷改善彝族居民的衣食住行，隨著生活水平得到極大的提高，在這種情況下，如果健康知識的宣教不能到位，勢必沖擊彝族居民的健康，慢性疾病的患病率會出現(xiàn)大幅度攀升，應(yīng)當(dāng)做好提早防備[9]。研究表明，經(jīng)濟(jì)快速增長的地區(qū)，居民或從農(nóng)村遷向城市，或從農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)向工業(yè)、商業(yè)或服務(wù)業(yè)，經(jīng)濟(jì)收入提高，膳食急速改變，幸福感覺增高，但是心理壓力，精神緊張也在增加[10]，同時體能鍛煉比較少，居民高血壓的患病率也在快速增長[11]。

彝族是第六大少數(shù)民族人口，2010 年第六次全國人口普查數(shù)據(jù)顯示，彝族人口有870 多萬人，主要居住在四川，云南，貴州和廣西的高原或丘陵地區(qū)。獨(dú)特的飲食居所、通婚制度、服飾裝束、山歌舞蹈、宗教信仰和禮儀節(jié)日等是彝族居民典型的文化特征[11]。近期的研究報道表明，彝族高血壓患病率較其他民族低，其原因還不完全清楚[12]。

本組資料顯示，彝族高血壓患者M(jìn)THFR C677T基因位點(diǎn)TT 純合子突變攜帶者其收縮壓，其舒張壓和HCY 水平高于CC 和CT 基因型。彝族非高血壓者M(jìn)THFR C677T 基因位點(diǎn)TT 純合子突變攜帶者HCY 水平高于CC 基因型， 其MTHFR C677T 不同基因型收縮壓，舒張壓水平?jīng)]有多大差別。彝族高血壓患者M(jìn)THFR C677T 基因TT 純合子突變頻率比較高，MTHFR C677T 基因TT 純合子突變者其收縮壓，舒張壓和HCY 水平高于CC 野生純合子、CT 雜合子。與國內(nèi)報道的相同或相似之處[13-21]，《中國高血壓防治指南2010》指出HCY ≥10μmol/L 為新的心血管危害要素，同時將伴有高同型半胱氨酸血癥（HHCY）的高血壓定義為H 型高血壓。MTHFR C677T 基因TT 純合子突變是MTHFR 基因第677 位點(diǎn)上的胞嘧啶變成胸腺嘧啶，其編碼的蛋白質(zhì)MTHFR 的第226 位點(diǎn)上的丙氨酸變成纈氨酸，突變生成的MTHFR 耐熱性降低，酶活性下降，嚴(yán)重影響機(jī)體甲基化的反應(yīng)循環(huán)，阻礙HCY 轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼岬乃俾?，產(chǎn)生HHCY。

流行病學(xué)調(diào)查表明，MTHFR C677T 突變和HHCY 是血管疾病比較明顯的影響因子，與腦卒中的發(fā)生緊密相關(guān)。早期發(fā)現(xiàn)并給予干涉，對防控腦卒中有重要作用。中國腦卒中一級預(yù)防研究（CSPPT）認(rèn)為，腦卒中的主要危險因素不僅僅是高血壓，還應(yīng)當(dāng)包括HHCY、血脂異常，肥胖，高血糖和血小板功能異常等，研究認(rèn)為高血壓與HHCY 的干預(yù)對防控腦卒中效果不錯[22-23]。

本項(xiàng)研究提示MTHFR C677T 基因位點(diǎn)TT 純合子突變與血漿HCY 高水平有關(guān)聯(lián)。當(dāng)然我們也應(yīng)當(dāng)明白，影響機(jī)體HCY 水平的因素是比較多的，除了MTHFR C677T 基因位點(diǎn)TT 純合子突變以外，還有蛋氨酸來源過多，葉酸、維生素B6、維生素B12缺乏等營養(yǎng)因素，還有慢性肝病，酒精性肝炎，另外年齡、抽煙和某些藥物等均可引起血HHCY。對于彝族高血壓患者預(yù)防與控制，應(yīng)當(dāng)針對不同的人群，采取不同的防治措施，才能提高防治效果。彝族居民在生活環(huán)境相差不大的條件下，其高血壓患病率能夠保持比較低的水平，與其優(yōu)秀的傳統(tǒng)文化生活習(xí)慣緊密相聯(lián)，值得我們深入的研究和傳承。