免疫系統(tǒng)是執(zhí)行免疫監(jiān)視、防御及調(diào)控功能的重要系統(tǒng)，能識(shí)別并清除發(fā)生異常的細(xì)胞，而惡性腫瘤有免疫抑制、免疫逃逸、無(wú)限增殖及轉(zhuǎn)移的能力。免疫治療通過(guò)人為刺激和改造免疫系統(tǒng)，提高腫瘤特異性免疫反應(yīng)并生成記憶免疫細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)持久的腫瘤消退和可能的治愈。目前已成功研發(fā)多種腫瘤免疫療法并實(shí)現(xiàn)了臨床應(yīng)用，包括外源性細(xì)胞因子［1］，腫瘤單克隆抗體如曲妥珠單抗、利妥昔單抗及貝伐珠單抗［2］，各種免疫檢查點(diǎn)抑制分子的抗體療法［3］，治療性疫苗如樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）疫苗，以及利用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體改造自體或異體淋巴細(xì)胞的過(guò)繼免疫治療［4-6］，這些方法取得了一定的療效。

體外轉(zhuǎn)錄信使RNA（in vitrotranscription messen?ger RNA，IVT mRNA）起初因其高免疫原性、低穩(wěn)定性和生產(chǎn)制備的局限性，被認(rèn)為是一種不適合的基因療法。近年來(lái)隨著mRNA合成、化學(xué)修飾mRNA和遞送技術(shù)的發(fā)展，mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率大幅提高，免疫原性逐步可控［7］，其在腫瘤免疫治療領(lǐng)域顯示了巨大的商業(yè)價(jià)值。mRNA藥物與其他生物治療藥物相比存在較多優(yōu)勢(shì)：1）mRNA易在體外生產(chǎn)和純化，除去蛋白藥物及病毒載體制備的復(fù)雜過(guò)程，同時(shí)可避免宿主蛋白及病毒源性污染；2）IVT mRNA的生產(chǎn)工藝通用性強(qiáng)，可以快速應(yīng)用于生產(chǎn)不同的目的蛋白，節(jié)省藥物研發(fā)時(shí)間，提高效率；3）mRNA僅需進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)即可翻譯成蛋白質(zhì)，無(wú)需進(jìn)入細(xì)胞核，因此不存在基因的插入和整合，提高藥物的安全性；4）通過(guò)調(diào)節(jié)序列修飾和遞送載體可以改變其半衰期；5）臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然mRNA的蛋白質(zhì)表達(dá)是短暫性的，但其對(duì)于腫瘤的免疫治療應(yīng)用有效，且有利于藥代動(dòng)力學(xué)和劑量的控制［8-9］。mRNA的腫瘤免疫療法受到越來(lái)越多研究者的青睞，其臨床研究邁上了新的臺(tái)階，增加了研究者開(kāi)發(fā)更有效的免疫治療策略的信心。

1 IVT mRNA的合成、純化及修飾

IVT mRNA在體外通常以包含啟動(dòng)子、5'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、基因編碼序列開(kāi)放讀框（open reading frame，ORF）和3'UTR的線性DNA（如線性pDNA、PCR產(chǎn)物）為模板，以4種核苷酸和人工合成的帽子類(lèi)似物（如m7GpppG、m27，3'-OGpppG）為原料，利用噬菌體RNA聚合酶（T7或SP6）轉(zhuǎn)錄出包含帽子的RNA，然后用DNA酶降解模板DNA，再利用多聚腺苷酸聚合酶以腺苷酸為原料合成PolyA尾巴，最后進(jìn)行分離和純化。通常mRNA的生產(chǎn)過(guò)程會(huì)生成一些雙鏈RNA的副產(chǎn)物，這種與病毒基因組和復(fù)制中間產(chǎn)物類(lèi)似的產(chǎn)物是一個(gè)潛在的病原體相關(guān)分子（pathogen-associated molecule，PAM），能被Toll樣受體3（Toll-like receptors，TLRs）識(shí)別，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。此外，單鏈RNA分子本身也是一種PAM，能被TLR7和TLR8識(shí)別，TLRs的激活會(huì)引起炎癥，最終導(dǎo)致mRNA的降解和翻譯抑制。在制備過(guò)程中對(duì)mRNA進(jìn)行純化，可以減少雙鏈mRNA的產(chǎn)生，減少細(xì)胞的免疫應(yīng)答［9］。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段的少量制備，主要用商業(yè)化的純化試劑盒去除多余的核苷酸、短寡核苷酸、帽子類(lèi)似物、RNA聚合酶、鹽等，對(duì)于臨床生產(chǎn)需制備大量高純度的RNA（如清除截?cái)嗟膍RNA、雙鏈RNA），可以使用高效液相色譜法（HPLC）［10］等方法進(jìn)行純化。

為提高mRNA穩(wěn)定性、翻譯效率及降低其免疫原性，可采取多種方法對(duì)其進(jìn)行改造和修飾，包括對(duì)提高mRNA穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)至關(guān)重要的5'和3'UTR區(qū)域序列的改進(jìn)和修飾（如采用β-珠蛋白的UTR），ORF密碼子的優(yōu)化（選擇與tRNA同源的密碼子），使用m27，3'-OGpppG帽子結(jié)構(gòu)，以及控制PolyA尾巴的長(zhǎng)度等［9］。盡管截至目前RNA轉(zhuǎn)錄修飾方法已超過(guò)100種［11］，但mRNA的轉(zhuǎn)錄修飾方法較少，主要包括尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ぃé罚?2］、N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ），腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)镹6-甲基腺苷（m6A）、N1-甲基腺苷（m1A），胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶（hm5C）、尿苷清除（UD）、5-甲氧基尿苷清除等［10，13-14］。研究表明通過(guò)引入化學(xué)修飾核苷酸可以顯著降低固有免疫反應(yīng)，提高mRNA活性，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾和純化的mRNA在DCs中可明顯提高蛋白表達(dá)量［15］。但也有研究表明，經(jīng)過(guò)純化未修飾序列優(yōu)化的mRNA能夠在HeLa細(xì)胞中產(chǎn)生比修飾過(guò)的mRNA更多的蛋白質(zhì)［16］。實(shí)際應(yīng)用中無(wú)論是采用純化還是修飾技術(shù)，應(yīng)根據(jù)靶細(xì)胞的類(lèi)型采用不同的mRNA合成與生產(chǎn)策略以達(dá)到最佳藥效。

2 基于mRNA的DCs腫瘤疫苗

DCs是攝取和處理抗原并將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞的專(zhuān)業(yè)抗原呈遞細(xì)胞（antigen-presenting cell，APCs）。mRNA因其制備簡(jiǎn)單，具有免疫原性可作為藥物本身的佐劑，由mRNA修飾的DCs抗癌疫苗受到廣泛的研究。DCs已成為刺激癌癥T細(xì)胞反應(yīng)的重要方法，其作用機(jī)制主要為腫瘤相關(guān)抗原mRNA進(jìn)入DCs胞質(zhì)后，翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，由蛋白水解機(jī)制水解為多肽，多肽與DCs的組織主要相容性復(fù)合物（major histocompatibility complexes，MHC）Ⅰ或Ⅱ結(jié)合呈遞至細(xì)胞表面，含有相應(yīng)抗原表位的T細(xì)胞識(shí)別MHC-多肽，增殖、分化為針對(duì)特異多肽的效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞MHC-特異性多肽而殺死腫瘤細(xì)胞，形成免疫記憶細(xì)胞，從而為抵御癌癥復(fù)發(fā)提供保障［17］。

2.1 基于mRNA的腫瘤疫苗抗原

目前用于DCs抗癌疫苗的抗原mRNA可以分為兩類(lèi)。

2.1.1 從腫瘤細(xì)胞系或患者自體腫瘤組織提取的總mRNA Mu等［18］采用3種腫瘤細(xì)胞系的總mRNA負(fù)載DCs疫苗治療19例雄激素耐受的前列腺癌患者，結(jié)果8例患者疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），11例病情穩(wěn)定（stable disease，SD），13例前列腺癌特異性抗原水平下降。Vik-Mo等［19］在腦膠質(zhì)瘤的臨床研究中證明，采用腫瘤干細(xì)胞提取的mRNA負(fù)載DCs疫苗使腦膠質(zhì)瘤患者無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）延長(zhǎng)2.9倍。因在總mRNA中含有一小部分腫瘤特異性抗原以及大量的非腫瘤特異性抗原，優(yōu)點(diǎn)是可能引起較全面的特異性反應(yīng)，應(yīng)用范圍擴(kuò)大且能制備個(gè)體化的疫苗，缺點(diǎn)是若切取患者自體腫瘤組織，可能會(huì)引起身體創(chuàng)傷，且制備復(fù)雜，其次因所含抗原復(fù)雜，可能含有引起免疫抑制的抗原，降低治療效果，近年鮮見(jiàn)新的臨床進(jìn)展。

2.1.2 體外人工合成的腫瘤抗原mRNA 包括腫瘤相關(guān)抗原或從患者腫瘤組織中經(jīng)過(guò)外顯子、基因組測(cè)序比對(duì)后篩選得到的腫瘤特異性抗原又稱(chēng)新抗原［20］。腫瘤相關(guān)抗原在腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，在正常組織中少量表達(dá)，包括睪丸癌抗原如人黑色素腫瘤抗原（human melanoma related antigen，MAGE）家族，NY-ESO-1和SSX抗原，分化抗原如MART-1/Melan-A、gp100、酪氨酸酶，Wilms腫瘤因子1（Wilms tumor factor 1，WT1）等［21］。新抗原是由隨機(jī)體細(xì)胞突變產(chǎn)生的不存在于正常細(xì)胞中的抗原［22］，與腫瘤相關(guān)抗原相比，新抗原可被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別為非自體，潛在地增加特異性、效率和安全性［23］，因此是免疫治療中較有吸引力的靶點(diǎn)。事實(shí)上，許多臨床前和臨床研究均表明新抗原引發(fā)的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）是最有效的腫瘤排斥T細(xì)胞群［24-25］。然而，自然情況下，患者體內(nèi)的新抗原特異性的CTL非常罕見(jiàn)，可能是由于低效的抗原呈遞和克隆數(shù)量少［26］。因此，有必要通過(guò)疫苗的形式增強(qiáng)對(duì)新抗原的有效免疫。此種策略的優(yōu)點(diǎn)是可以規(guī)?；苽淇乖璵RNA，引起明確的特異性反應(yīng)，缺點(diǎn)是特異性反應(yīng)范圍較窄。目前臨床上常用多個(gè)抗原mRNA共轉(zhuǎn)導(dǎo)至DCs［27-28］。

2.2 mRNA腫瘤疫苗遞送策略

將mRNA導(dǎo)入DCs中是抗癌疫苗制備非常重要的步驟，目前臨床上主要有兩種方法。

2.2.1 從患者外周血提取DCs 采用巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-4（interleukin-4，IL-4）或IL-15等刺激DCs分化成熟，電脈沖轉(zhuǎn)染腫瘤抗原基因的mRNA，然后回輸至患者體內(nèi)［27］。此種方法的優(yōu)勢(shì)是mRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入DCs的效率高，在臨床試驗(yàn)中被證明安全和有效，但體外培養(yǎng)自體DCs屬于個(gè)體化生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，屬于勞動(dòng)密集型，工藝復(fù)雜，并且需要高技能的技術(shù)人員進(jìn)行制造，極大地限制其在臨床中的廣泛應(yīng)用［29］。盡管如此，目前許多治療不同類(lèi)型癌癥的臨床試驗(yàn)均采用此類(lèi)方法，取得了良好的臨床療效。

Aarntzen等［30］將gp100及酪氨酸酶的mRNA負(fù)載DCs，治療26例Ⅲ期及19例Ⅳ期黑素瘤患者。Ⅲ期患者中，1例PD，12例持續(xù)緩解；Ⅳ期患者中，6例SD，1例部分緩解（partial remission，PR），1例于3次DCs注射后出現(xiàn)PR，手術(shù)切除原發(fā)病灶后繼續(xù)行DCs疫苗治療，結(jié)果淋巴結(jié)及上頜竇轉(zhuǎn)移病灶持續(xù)縮小并最終消失，該患者完全緩解（complete remission，CR）持續(xù)52周以上。Wilgenhof等［27-28］通過(guò)編碼CD40配體、Toll樣受體4、CD70、黑色素瘤相關(guān)抗原（MAGE-A3、MAGE-C2、tyrosinase或gp100）和人白細(xì)胞抗原（HLA）Ⅱ類(lèi)靶向信號(hào)融合蛋白的mRNA負(fù)載DCs疫苗（TriMixDC-MEL），在臨床Ⅰb期中15例晚期黑色素瘤患者，2例CR，2例PR；在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，39例晚期黑色素瘤患者接受TriMixDC-MEL疫苗聯(lián)合ipilimumab治療，8例完全反應(yīng)，7例部分反應(yīng)，6例SD。Anguille等［31］在臨床Ⅱ期試驗(yàn)中，采用編碼WT1的mRNA疫苗治療并預(yù)防急性髓系白血病復(fù)發(fā)，30例患者中白血病復(fù)發(fā)13例；9例病情緩解中，5例于中位隨訪109.4個(gè)月后持續(xù)緩解，4例SD。5年總體生存率（overall survival，OS）應(yīng)答者高于無(wú)應(yīng)答者，在首次CR中接受DCs的患者中，WT1疫苗誘導(dǎo)的復(fù)發(fā)率降低了25%。

Khoury等［32］將人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶及溶酶體靶向序列的mRNA負(fù)載DCs，治療16例首次CR，3例兩次CR及2例早期病情復(fù)發(fā)的急性髓性白血病患者（acute myelogenous leukemia，AML），結(jié)果表明58%的CR患者（19例患者中的11例）在最后一次隨訪時(shí)未復(fù)發(fā)；57%的患者年齡≥60歲（7例中的4例）也被發(fā)現(xiàn)在平均隨訪54個(gè)月中無(wú)復(fù)發(fā)。Batich等［33］對(duì)劑量加強(qiáng)的替莫唑胺預(yù)處理后，行巨細(xì)胞病毒抗原（cytomegalovi?rus，CMV）-pp65的mRNA負(fù)載DCs治療11例腦膠質(zhì)瘤患者，臨床結(jié)果表明極大增強(qiáng)了患者pp65細(xì)胞反應(yīng)，平均PFS 25.3個(gè)月，平均總生存期41.1個(gè)月，4例患者在確診后59～64個(gè)月仍無(wú)PD。Reap等［34］進(jìn)一步對(duì)17例腦膠質(zhì)瘤患者行隨機(jī)CMV pp65-特異性T細(xì)胞聯(lián)合CMV pp65的mRNA負(fù)載DCs疫苗治療，或鹽水替代CMV pp65的mRNA負(fù)載DCs疫苗治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CMV pp65的mRNA負(fù)載DCs疫苗可以顯著地提高CMV pp65 CD8+T細(xì)胞分泌IFNγ+、TNFα+、CCL3+的多功能能力，該結(jié)果表明適應(yīng)性T細(xì)胞和DCs疫苗的聯(lián)合治療是潛在抗腫瘤療法，有待進(jìn)一步研究。

2.2.2 直接原位注射mRNA疫苗 臨床應(yīng)用時(shí)，可在患者皮下、淋巴結(jié)、瘤內(nèi)等直接注射裸露的mRNA、魚(yú)精蛋白或納米顆粒包裹的mRNA［35］。但調(diào)控IVT mRNA的翻譯效率仍然具有挑戰(zhàn)性。裸露mRNA可通過(guò)清道夫受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被多種細(xì)胞自發(fā)吸收。因此，僅一小部分mRNA可被APCs捕獲并到達(dá)細(xì)胞質(zhì)行后續(xù)的翻譯和抗原呈遞。為了使APCs對(duì)抗原的捕獲最大化，裸露mRNA可以通過(guò)皮膚針刺直接進(jìn)入淋巴結(jié)。Sahin等［36］對(duì)晚期黑色瘤患者通過(guò)淋巴結(jié)注射個(gè)體化的編碼多個(gè)新抗原表位的mRNA，所有患者接種疫苗后均產(chǎn)生對(duì)應(yīng)抗原表位的強(qiáng)有力的T免疫反應(yīng)，盡管淋巴結(jié)注射有效且安全，但需要重復(fù)注射（最多接種20次），降低了該策略的實(shí)用性。但原位直接注射mRNA疫苗目前主要用于治療或預(yù)防感染性疾?。?5］，在腫瘤治療上仍處于研發(fā)階段［37］，臨床研究較少，可能是mRNA原位遞送效率低，而mRNA在體外導(dǎo)入DCs的效率高，引起的特異性腫瘤反應(yīng)更高效。

3 基于mRNA的T細(xì)胞腫瘤免疫治療

除了使用mRNA制備腫瘤疫苗，也可以使用編碼腫瘤特異性T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的mRNA直接改造T細(xì)胞，產(chǎn)生腫瘤特異性效應(yīng)T細(xì)胞。TCR-T細(xì)胞免疫治療在黑色素瘤等實(shí)體腫瘤的臨床試驗(yàn)顯示良好的安全性及抗腫瘤效果［38］，CAR-T細(xì)胞免疫治療在B淋巴瘤等血液腫瘤中取得良好的抗腫瘤效果［39］。臨床上的TCR-T和CAR-T主要使用病毒載體制備，但病毒載體制備工藝復(fù)雜，存在基因整合至T細(xì)胞基因組的風(fēng)險(xiǎn)。目前已有一些臨床試驗(yàn)采用mRNA替代病毒載體行腫瘤免疫治療。

Beatty等［40］臨床試驗(yàn)中2例患者的自體T淋巴細(xì)胞體外電轉(zhuǎn)靶向間皮素抗原的CAR mRNA，其中對(duì)轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者行靜脈注射及瘤內(nèi)注射，對(duì)惡性胸膜間皮瘤患者進(jìn)行靜脈注射，結(jié)果證明自體T細(xì)胞CAR mRNA過(guò)繼治療安全，且能引發(fā)廣泛的抗腫瘤反應(yīng)。Svoboda等［41］通過(guò)mRNA瞬時(shí)表達(dá)CD19嵌合受體的CAR-T細(xì)胞治療經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（cHL），4例患者在1個(gè)月的反應(yīng)評(píng)估中，1例CR、1例PR、1例SD、1例PD。在臨床前研究中，通過(guò)體外電轉(zhuǎn)HBV抗原特異性的TCR mRNA至自體T細(xì)胞，治療肝移植后復(fù)發(fā)的肝癌患者，結(jié)果顯示該方案有良好的安全性且患者腫瘤縮小，目前該項(xiàng)研究已獲得新加坡臨床試驗(yàn)批準(zhǔn)［42-43］。因mRNA僅是瞬時(shí)表達(dá)（經(jīng)過(guò)修飾后目前可持續(xù)表達(dá)1周［9］），使用mRNA制備的細(xì)胞需進(jìn)行多個(gè)批次制備，而每批次均需要進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，而病毒載體介導(dǎo)的T細(xì)胞改造可以每個(gè)患者一個(gè)批次生產(chǎn)，具有體內(nèi)擴(kuò)增和更長(zhǎng)的持久性。因此目前基于mRNA的CAR-T、TCR-T免疫治療主要處于研發(fā)階段及臨床前的T細(xì)胞靶點(diǎn)安全性、可行性與有效性的篩選。

4 機(jī)遇與挑戰(zhàn)

近年，隨著mRNA技術(shù)的發(fā)展，mRNA療法越來(lái)越廣泛應(yīng)用于臨床研究。早期的mRNA療法主要專(zhuān)注于傳染性疾病治療［35］，最近越來(lái)越多的研究將mRNA療法應(yīng)用于腫瘤免疫治療并取得了積極的療效［9］。體外電脈沖導(dǎo)入mRNA的DCs疫苗有著良好的發(fā)展前景，但在制備和擴(kuò)增方面存在諸多局限。目前正在研究替代細(xì)胞，如B淋巴細(xì)胞就是一種頗具潛力的APCs，較DCs有更強(qiáng)增殖能力，且能增加淋巴細(xì)胞器官靶向性［44］。另一個(gè)策略是使用更易制造的模擬天然APCs功能的合成APCs［45］。同時(shí)DCs疫苗特異性抗原及TCR-T、CAR-T治療靶點(diǎn)的篩選也是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)［26］，此外需設(shè)計(jì)構(gòu)造出生物兼容性新型智能生物遞送策略，以實(shí)現(xiàn)多個(gè)甚至十幾個(gè)抗原同時(shí)原位遞送至APCs，引發(fā)多種多樣的特異性T細(xì)胞，發(fā)揮腫瘤殺傷作用。雖然mRNA療法作為發(fā)展中的技術(shù)，仍有很多問(wèn)題亟待解決，如需提高其本身在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)成本的合理化，提高原位轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等，但mRNA在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)顯現(xiàn)良好的前景，其商業(yè)化指日可待。