宗 航， 田博文， 張 瑞， 賴振雨， 周子惠， 吳 菲， 雷初朝， 黨瑞華

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

高等動(dòng)物的配子體外發(fā)生技術(shù)的研究進(jìn)程較為緩慢，主要有兩方面原因。首先，相對(duì)于各組織均可再生的后生動(dòng)物門，哺乳動(dòng)物及鳥類，尤其人類的再生受到嚴(yán)重限制甚至缺乏再生能力，不同組織器官的再生能力差異也十分顯著[1]。其次，配子發(fā)生過程經(jīng)歷在多個(gè)不同的組織結(jié)構(gòu)中，發(fā)育的時(shí)間亦有間隔性，且存在有絲分裂以及減數(shù)分裂的2個(gè)分裂過程，細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控通路多且復(fù)雜，參與調(diào)控的物質(zhì)多，視黃酸(retinoid acid，RA)、孕酮、類無精癥缺失基因(deleted in azoospermia-like gene，Dazl)編碼的RNA結(jié)合蛋白等物質(zhì)均參與了減數(shù)分裂的調(diào)控[2-7]。自O(shè)dor等[8]證明可以通過培養(yǎng)小塊卵巢在體外產(chǎn)生大量卵母細(xì)胞以來，近期該研究領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展。Hikabe等[9]通過加入卵巢細(xì)胞等的方法，在30 d內(nèi)通過對(duì)成纖維細(xì)胞衍生的多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)，產(chǎn)生了具有受精能力的小鼠卵母細(xì)胞。本文將論述近期配子體外發(fā)生技術(shù)的進(jìn)展及其廣泛的應(yīng)用前景。

1 配子體內(nèi)發(fā)生過程

配子發(fā)生需要經(jīng)過幾個(gè)嚴(yán)格的步驟，包括原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)的形成、增殖，遷移到生殖嵴，分化成成熟的配子幾個(gè)過程[10]。

1.1 原始生殖細(xì)胞的形成、增殖與遷移

在胚外組織細(xì)胞分泌的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)下，原始生殖細(xì)胞首先在早期胚胎的上胚層中形成[11-12]，經(jīng)有絲分裂后，數(shù)目增加并聚集于胚外中胚層和內(nèi)胚層附近的原條中。在此期間BMP蛋白家族及無翼型小鼠乳腺腫瘤病毒整合位點(diǎn)蛋白家族(wingless-type mouse mammary tumor virus integration site family member，WNT)與PGCs表面受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)通路，維持PGCs的多能性[13-14]。小鼠PGCs的遷移起始于8日胎齡時(shí)，生殖嵴分泌干細(xì)胞衍生因子Ⅰ(stromal cell-derived factor1，SDF1)與PGCs細(xì)胞表面趨化因子受體Ⅳ(chemokine receptor type4，CXCR4)結(jié)合，后腸分泌干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(stem cell growth factor，SCF)與PGCs細(xì)胞表面干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(KIT receptor，c-kit)結(jié)合，共同趨化PGCs遷移至生殖嵴[15-17]。

1.2 配子細(xì)胞的分化與成熟

PGCs定植于性腺嵴后，經(jīng)過一段時(shí)間快速的有絲分裂，使數(shù)目大量增加[18]，快速進(jìn)入下一階段。與生殖嵴緊密相連的中腎細(xì)胞立即分泌RA。對(duì)于雄性個(gè)體，PGCs上調(diào)細(xì)胞色素P450家族成員26B1重組蛋白(cytochrome P450，family 26，member B1，CYP26B1)表達(dá)，抑制RA的積累[19]。進(jìn)而抑制RA下游視黃酸誘導(dǎo)基因8(stimulated by retinoic acid gene，Stra8)表達(dá)，Stra8基因是減數(shù)分裂過程關(guān)鍵表達(dá)基因[20]，因而雄性生殖細(xì)胞分化停止。直至雄性個(gè)體性成熟后，生殖細(xì)胞合成視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)，連續(xù)完成減數(shù)分裂全過程形成成熟精子。對(duì)于雌性個(gè)體，RA在細(xì)胞內(nèi)的積累會(huì)激活Stra8基因，開始減數(shù)分裂，并停止于減數(shù)第1次分裂前期。性成熟后，雌性生殖細(xì)胞繼續(xù)減數(shù)分裂，并停止于減數(shù)第2次分裂中期，直到受精后完成分裂全過程[21]。

2 配子體外發(fā)生技術(shù)

配子體外發(fā)生過程可以分為3個(gè)部分：體外分化期、體外生長(zhǎng)期、體外成熟期。體外分化即通過培養(yǎng)多潛能干細(xì)胞，誘導(dǎo)其在體外定向分化、形成初級(jí)卵母或精母細(xì)胞的過程。體外生長(zhǎng)是配子在體外完成完整的減數(shù)分裂過程。體外成熟是指已受精的卵細(xì)胞在體外的早期培養(yǎng)并正常發(fā)生卵裂過程，以及完成減數(shù)分裂的精細(xì)胞體外變形成精子的過程。

2.1 配子的體外分化

初級(jí)卵母細(xì)胞或精母細(xì)胞可以分離胚胎期的干細(xì)胞經(jīng)分化后產(chǎn)生，如胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs)、外胚層干細(xì)胞(epiblast stem cells，EpiSCs)、PGCs等，也可以通過成體干細(xì)胞(Adult Stem Cell，ASCs)的誘導(dǎo)分化產(chǎn)生。Hübner等[22]通過體外培養(yǎng)首次證明了ESCs體外具有形成卵母細(xì)胞的能力，并在培養(yǎng)基中形成了類似的卵泡結(jié)構(gòu)，但具有很大的隨機(jī)性。Nayernia等[23]使用RA誘導(dǎo)，使成年小鼠骨髓干細(xì)胞成功分化精細(xì)胞，表明成體干細(xì)胞具有分化成生殖細(xì)胞的潛能，但試驗(yàn)中仍存在部分細(xì)胞減數(shù)分裂停滯的現(xiàn)象。早期研究中的配子體外分化過程主要基于胚胎干細(xì)胞隨機(jī)分化后極少數(shù)的生殖相關(guān)干細(xì)胞的篩選，因而產(chǎn)生配子效率低，不易產(chǎn)生成活且健康的后代。

在之后的研究中，主要通過體外外胚層環(huán)境的構(gòu)建、關(guān)鍵化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)定向產(chǎn)生功能性的生殖相關(guān)干細(xì)胞。Nicholas等[24]在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入RA、BMP4、SCF等物質(zhì)成功誘導(dǎo)分化形成初級(jí)卵母細(xì)胞，并導(dǎo)入至小鼠卵巢中發(fā)育成熟。Hayashi等[25]從6.5日胎齡的小鼠胚胎外胚層中分離EpiSCs，使用BMP4誘導(dǎo)分化形成PGCs，并與12.5日胎齡胚胎提取的雌性性腺共同培養(yǎng)。雖然成功分化形成類似的卵母細(xì)胞，但效率較低，卵母細(xì)胞不易成活。Hayashi等[26]從3.5日胎齡的小鼠胚胎中提取胚胎干細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入MEK抑制劑(PD325901)、GSK3抑制劑(CT99021)及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)誘導(dǎo)形成類似的外胚層干細(xì)胞，構(gòu)建形成PGCs的外部環(huán)境，并在形成的第2天加入BMP4、SCF、LIF誘導(dǎo)分化形成PGCs[27]，導(dǎo)入缺乏內(nèi)源性生殖細(xì)胞的小鼠曲細(xì)精管中，成功產(chǎn)生精子，受精后成功產(chǎn)下健康后代。

在最新的研究中，Hikabe等[9]利用小鼠皮膚細(xì)胞、尾細(xì)胞中含有的ASCs，誘導(dǎo)分化成ESCs，采用Hayashi等[27]的方法誘導(dǎo)形成初級(jí)卵母細(xì)胞，并與卵巢體細(xì)胞混合，重構(gòu)為“卵巢”，并將重構(gòu)的卵巢置于涂覆有膠原蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生了大量具有卵泡結(jié)構(gòu)的卵母細(xì)胞。該步驟是本試驗(yàn)中創(chuàng)新性一步，通過卵巢細(xì)胞混合培養(yǎng)，提供卵母細(xì)胞分化精細(xì)的外部環(huán)境，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了從有絲分裂到減數(shù)分裂復(fù)雜分裂過程的跨越，最終實(shí)現(xiàn)了卵母細(xì)胞的體外成熟，體外完整的配子發(fā)育過程。早在先前的研究中，已經(jīng)證明PGCs與卵巢體細(xì)胞的組合可以在功能上形成重建的性腺，進(jìn)而形成初級(jí)卵母細(xì)胞。移植體內(nèi)后，可完成配子發(fā)育的全過程[24,28-29]。Morohaku等[30]也通過卵巢細(xì)胞和卵母細(xì)胞的混合培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了卵母細(xì)胞的體外成熟。

2.2 配子的體外生長(zhǎng)

大量的試驗(yàn)證明，體外培養(yǎng)形成的初級(jí)卵母細(xì)胞跨越減數(shù)分裂過程是十分困難的[2,29,31]，而顆粒細(xì)胞的形成、卵泡的構(gòu)建也被認(rèn)為是卵母細(xì)胞形成的必要條件[3]。Eppig等[32]認(rèn)為卵母細(xì)胞的成功構(gòu)建關(guān)鍵在于維持顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的信息交流，而顆粒細(xì)胞在調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞發(fā)育中的作用取決于顆粒細(xì)胞的分化階段。因此，減數(shù)分裂及卵泡的成功構(gòu)建是卵母細(xì)胞在體外生長(zhǎng)中關(guān)鍵的兩步，其中雌激素等化學(xué)物質(zhì)起關(guān)鍵性作用。Kezele等[33]認(rèn)為雌激素在卵泡形成中存在抑制作用。Chen等[34]證明了雌激素通過細(xì)胞表面受體抑制卵母細(xì)胞囊腫的分解和卵泡的構(gòu)建。Lees-Murdock等[4]發(fā)現(xiàn)SCF能夠促進(jìn)卵泡的組裝，但不能使卵母細(xì)胞發(fā)育到次級(jí)卵母細(xì)胞。

Zhang等[7]通過將收集的小鼠PGCs細(xì)胞培養(yǎng)在前腔期顆粒細(xì)胞上，形成成熟的卵母細(xì)胞并受精，培養(yǎng)至桑葚胚階段。Zhang等[35]將新生小鼠睪丸細(xì)胞(初級(jí)精母細(xì)胞時(shí)期)注射于裸鼠背部，形成了睪丸組織及精子的發(fā)生，產(chǎn)生了可育后代。Hikabe等[9]將該技術(shù)改進(jìn)，又在培養(yǎng)基中加入了聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)以及雌激素受體抑制劑(oestrogen inhibitor，ICI)。PVP是一類具有優(yōu)秀生理相容性和以及溶解性能的高分子化合物，可以在培養(yǎng)基中提供較大的膠體滲透壓[36-37]。Hikabe等[9]實(shí)驗(yàn)表明PVP可以維持卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞復(fù)合體的穩(wěn)定性，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖。配子在體內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到激素的嚴(yán)密調(diào)控。同樣，在體外的條件下經(jīng)激素的嚴(yán)格調(diào)控，配子才能實(shí)現(xiàn)完整的發(fā)育過程。在培養(yǎng)過程中加入雌激素抑制劑，降低培養(yǎng)基中由顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的雌激素的濃度，才能使卵母細(xì)胞正常分裂且卵泡成功組裝[33-34]。

而對(duì)于精母細(xì)胞，由于其減數(shù)分裂是連續(xù)的進(jìn)程，體外過程更為容易實(shí)現(xiàn)。Zhou等[38]將PGCs與新生小鼠睪丸細(xì)胞在RA、BMP蛋白家族存在的條件下共培養(yǎng)，在第6天添加卵泡雌激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)，在第14天便完成減數(shù)分裂產(chǎn)生精子細(xì)胞，將精子細(xì)胞注入減Ⅱ中期卵母細(xì)胞，成功受精并產(chǎn)下后代。

2.3 配子的體外成熟

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟過程，早在1959年已經(jīng)實(shí)現(xiàn)[39]。而Steptoe等[40]最早應(yīng)用于人類，“試管嬰兒”就是其較為成熟的應(yīng)用。但這只是發(fā)育十分成熟的卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)，而對(duì)于較早階段的卵母細(xì)胞，雖已在很多哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)，但人類中還未成功受精并產(chǎn)下健康后代。造成這種情況的原因包括：人類卵子發(fā)生過程的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)月，在延長(zhǎng)期內(nèi)維持人類卵母細(xì)胞的生存能力的困難， 以及可供研究的人類卵母細(xì)胞的稀缺性。而對(duì)于精子細(xì)胞體外成熟過程，未見有報(bào)道。

3 應(yīng)用及展望

3.1 提高動(dòng)物繁殖力，促進(jìn)育種進(jìn)程

配子體外發(fā)生技術(shù)的研究，不僅有助于了解卵子發(fā)生的調(diào)控機(jī)制，調(diào)控卵子發(fā)生，而且有助于提高哺乳動(dòng)物以及其他動(dòng)物的繁殖力[41]，大大提高動(dòng)物生產(chǎn)效率。通過優(yōu)良畜禽體外的配子發(fā)生，可以產(chǎn)生大量的配子細(xì)胞，與體外受精，胚胎移植等技術(shù)相結(jié)合，快速產(chǎn)生大量?jī)?yōu)良后代，加快育種進(jìn)程。同時(shí)，該技術(shù)對(duì)野生動(dòng)物的馴化具有重要意義。在自然界中有大量的物種可供人類使用，但經(jīng)人類馴化成功并大量利用生產(chǎn)的只有幾種。很多物種在馴化的初期圈養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)生殖障礙的現(xiàn)象，從而使該物種難以馴化甚至不能馴化。利用此技術(shù)可以加快特種動(dòng)物馴化馴養(yǎng)進(jìn)程，人類可利用的種質(zhì)資源將大大增加。

3.2 醫(yī)學(xué)上用于治療不孕不育

可以使用皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)分化形成性母細(xì)胞，以代替自然狀態(tài)下卵巢或睪丸的功能產(chǎn)生配子。也可以將多功能胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入到損傷、無法生成配子的睪丸或卵巢中，使之功能重現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)不孕不育的治療[24,42]。如果該技術(shù)可以適應(yīng)人類細(xì)胞的必要的安全性要求，它將繞過女性生育能力的主要限制因素，即卵母細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量[43]。作為一種治療不孕的方法，該方法可以幫助年輕婦女卵巢功能不全、接受體外受精的不孕婦女、因癌癥治療而導(dǎo)致生育能力受損的癌癥幸存者和絕經(jīng)后婦女。這種治療策略已經(jīng)應(yīng)用于原發(fā)性的卵巢功能不全的患者，并且產(chǎn)生了健康的胎兒[44-45]。而對(duì)于睪丸功能受損的男性，也具有良好的治療效果，通過SCF、BMP4、LIF等多種物質(zhì)的合理組合，高效地實(shí)現(xiàn)精原干細(xì)胞地誘導(dǎo)，成功治療不育小鼠并產(chǎn)下健康后代[46]。

3.3 與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在很多動(dòng)物中有所限制，例如禽類的轉(zhuǎn)基因，由于操作早期胚胎的困難，仍然非常低效。無論是逆轉(zhuǎn)錄病毒法，還是顯微注射法，甚至是早期胚胎細(xì)胞培養(yǎng)法轉(zhuǎn)基因的傳遞效率都非常低。調(diào)整技術(shù)次序，重構(gòu)其配子發(fā)生可克服這種技術(shù)障礙[47]?？梢酝ㄟ^皮膚細(xì)胞等具有誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞潛力的細(xì)胞體外培養(yǎng)，并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染轉(zhuǎn)基因。然后再誘導(dǎo)去分化、再分化生成PGCs，體外配子發(fā)生或?qū)GCs移植到睪丸或卵巢中完成了整個(gè)配子發(fā)生過程。

3.4 推動(dòng)生殖生物學(xué)的發(fā)展

成功的體外配子發(fā)生為人類生殖細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)方面提供非常有價(jià)值的信息，包括轉(zhuǎn)錄控制、表觀遺傳重編程、減數(shù)分裂和基因組穩(wěn)定性的機(jī)制[48]。這些知識(shí)反過來有助于辨別異常生殖細(xì)胞發(fā)育疾病，包括不孕不育，發(fā)育受損，生殖生理障礙，以及多種的遺傳或表觀遺傳的疾病[49]，促進(jìn)早期疾病胚胎的篩選。