韓天飛，劉 娜，張青青，趙建梅，李月華，黃秀梅，王 琳，王 娟，趙 格，劉俊輝，王君瑋，曲志娜，祁克宗

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036）

抗菌藥對(duì)畜禽細(xì)菌性疾病具有預(yù)防和治療作用并能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，因此廣泛用于畜牧生產(chǎn)活動(dòng)中。2013 年，我國(guó)生產(chǎn)和使用抗菌藥就分別達(dá)到24.8 萬t 和16.2 萬t，其中約52%是用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[1]?？咕幋罅渴褂脤?dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題變得日益嚴(yán)峻，根本原因是耐藥基因在環(huán)境選擇壓力下的產(chǎn)生和擴(kuò)散。2009 年7 月，國(guó)際抗菌藥耐藥基因數(shù)據(jù)庫（antibiotic resistance genes database，ARDB）已收錄了23 137 條抗菌藥耐藥基因序列，包括380 種耐藥基因亞型，涉及249 種抗菌藥物、267 個(gè)菌屬、1 737 個(gè)菌種、632 個(gè)細(xì)菌基因組、2 881 個(gè)耐藥基因載體[2]。耐藥基因可通過質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)元件在不同細(xì)菌間傳播，也可以在動(dòng)物、人和環(huán)境之間傳播。細(xì)菌一旦獲得了耐藥基因，就可以使相應(yīng)的抗菌藥失效，而當(dāng)細(xì)菌獲得多種耐藥基因時(shí)，就會(huì)使得該細(xì)菌引起的疾病變得難以救治?？咕幠退幮詥栴}已變得十分嚴(yán)重，而深入研究抗菌藥耐藥機(jī)制、了解耐藥基因特性是遏制細(xì)菌耐藥的基礎(chǔ)工作。本文將對(duì)常見的抗菌藥耐藥基因進(jìn)行綜述，以期為細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)與控制提供參考。

1 β-內(nèi)酰胺類

β-內(nèi)酰胺酶是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥最常見的耐藥因素。細(xì)菌通過表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶消減了β-內(nèi)酰胺類抗菌藥的殺菌作用，從而對(duì)此類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。

目前，已報(bào)道的β-內(nèi)酰胺酶主要包括青霉素酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）、頭孢菌素酶（AmpC）、金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBL）和碳青霉烯酶（KPC），其中產(chǎn)ESBL 菌廣泛流行。CTX-M 型產(chǎn)ESBL 菌主要是位于質(zhì)粒上的CTX-M 型（p-CZTX-M）耐藥基因編碼而成的。根據(jù)氨基酸的結(jié)構(gòu)可以將CTX-M 型分為5個(gè) 大 群：CTX-M-1、CTX-M-2、CTX-M-8、CTX-M-9 和CTX-M-25。在最近的研究中還發(fā)現(xiàn)有CTX-M-74 和CTX-M-75 兩個(gè)群[3]。近年國(guó)內(nèi)主要流行CTX-M-1 群和CTX-M-9 群。來源于禽源、豬源、人源、食源、伴侶動(dòng)物以及環(huán)境中的耐藥菌主要含有的CTX-M 型是CTX-M-1 群和CTX-M-9 群[4-6]。

目前國(guó)內(nèi)CTX-M 型產(chǎn)ESBL 菌逐漸增多并成為主流趨勢(shì)，其原因很可能與多種攜帶此類耐藥基因的質(zhì)粒有關(guān)。在動(dòng)物源大腸桿菌中分離得到了多種攜帶CTX-M-14 的質(zhì)粒，分別為lncK、IncH12、IncH11、IncN、IncF1B、IncF 和Incl1[4]。TEM 型β-內(nèi)酰胺酶的耐藥基因總體呈現(xiàn)檢出率高、亞型多樣的特點(diǎn)。舒剛等[7]在2006—2012 年四川、重慶患病豬、雞、鴨和奶牛的大腸桿菌中檢測(cè)出blaTEM，檢出率高達(dá)84.09%。TEM 亞型通常是由TEM-1、TEM-2 突變而來，在國(guó)內(nèi)已報(bào)道的有TEM-1、TEM-2、TEM-7、TEM-8、TEM-9、TEM-116、TEM-135、TEM-151。另外，碳青霉烯酶類的耐藥基因在國(guó)內(nèi)逐漸有零星報(bào)道，雖未產(chǎn)生重大影響，但需要時(shí)刻監(jiān)測(cè)。

2 喹諾酮類

喹諾酮類抗菌藥的耐藥機(jī)制主要通過抑制DNA 解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶，從而干擾細(xì)菌DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的過程，包括兩類基因突變和質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因的獲得。

第一類是DNA 回旋酶中g(shù)yrA和gyrB編碼的A 亞基和B 亞基發(fā)生突變[8]。gyrA編碼的氨基酸Ala67-Gln106 和gyrB編碼的氨基酸Asp426-Lys447 區(qū)域稱為喹諾酮抗性決定區(qū)（QRDR）。在此區(qū)域中，突變最常出現(xiàn)在密碼子83 和87 處。該活性部位的突變可能會(huì)改變喹諾酮類藥物與該部位的結(jié)合，從而降低對(duì)喹諾酮類藥物的敏感性。國(guó)內(nèi)有研究[9]發(fā)現(xiàn)，gyrA基因第83 和87 位點(diǎn)氨基酸共同突變的突變率最高達(dá)到69.25%，并且當(dāng)?shù)?3和第87 氨基酸位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，大腸桿菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥明顯增強(qiáng)。

第二類是拓?fù)洚悩?gòu)酶IV 中分別由parC和parE編碼的C 亞基和E 亞基發(fā)生突變[8]。發(fā)生parC或parE突變不會(huì)產(chǎn)生高水平的喹諾酮耐藥，但是當(dāng)gyrA發(fā)生突變并伴隨著parC或parE發(fā)生突變則可以產(chǎn)生高水平的喹諾酮耐藥現(xiàn)象[10]，可以看出gyrA突變對(duì)于引起喹諾酮耐藥起到十分重要的作用。此外，相比其他喹諾酮類耐藥機(jī)制，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥性（PMQR）為低水平的耐藥。這種質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制包括：保護(hù)DNA 免受喹諾酮結(jié)合的Qnr 樣蛋白，修飾某些AAC（6'）-Ibcr 乙酰轉(zhuǎn)移酶以及主動(dòng)外排泵蛋白。

雖然喹諾酮耐藥性主要是細(xì)菌基因組突變的結(jié)果，但是PMQR 已經(jīng)越來越多地在腸桿菌科中被報(bào)道：醫(yī)院和養(yǎng)殖場(chǎng)中主要流行的是qnrS和qnrB[11-13]；oqxAB最早在耐喹乙醇的大腸埃希菌的質(zhì)粒pOLA52 中被發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中[14]；另外aac（6'）-Ib-cr基因在大腸桿菌和沙門氏菌中的檢出率也在持續(xù)升高，已具有廣泛流行的趨勢(shì)。不斷增加的研究證據(jù)表明，PMQR 介導(dǎo)的耐藥正在向高水平耐藥發(fā)展。

3 氨基糖苷類

氨基糖苷類抗菌藥自20 世紀(jì)40 年代發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)大多數(shù)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌引起的疾病都有很好的療效，因此在醫(yī)學(xué)臨床、獸醫(yī)學(xué)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)得到廣泛應(yīng)用。該類藥物的耐藥機(jī)制主要有兩種：第一種是氨基糖苷類修飾酶對(duì)抗菌藥的修飾作用。該修飾酶根據(jù)反應(yīng)類型的不同可以分為3 種：N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（N-acetyltransferases，AAC）、O-核苷轉(zhuǎn)移酶（O-nucleotidyltransferase，ANT）和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶（O-phosphotransferases，APH），在細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒上均有發(fā)現(xiàn)。

第二種是外源性16SrRNA 甲基化酶通過甲基化細(xì)菌16SrRNA 中A 位點(diǎn)的特定核苷酸，使氨基糖苷類藥物不能與之結(jié)合，從而產(chǎn)生耐藥，這是一種由質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[15]。目前已發(fā)現(xiàn)11 種外源性16SrRNA 甲基化酶。

國(guó)內(nèi)引起氨基糖苷類耐藥的主要機(jī)制是修飾酶對(duì)抗菌藥的修飾作用，其中以aac（6'）-Ib/Ibcr、aac（3）-Ⅱ、aph（3'）-I為主要流行型[16-19]，檢出率較高；相比前者，外源性16SrRNA 甲基化酶的相關(guān)耐藥基因的流行程度相對(duì)較低，檢出率普遍低于10%[17-19]，流行型為armA和rmtB。

4 磺胺類

磺胺類抗菌藥通過干擾細(xì)菌內(nèi)葉酸合成，從而達(dá)到抑菌目的。細(xì)菌通過產(chǎn)生低親和力的二氫葉酸合成酶以獲得耐藥性，而sul1、sul2和sul3可以提高這種酶的表達(dá)，并隨著質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及整合子/基因盒系統(tǒng)等元件擴(kuò)散[20]。另外，甲氧芐啶（TMP）是一種人工合成的葉酸結(jié)構(gòu)類似物，是細(xì)菌二氫葉酸還原酶（DHFR）的競(jìng)爭(zhēng)抑制劑。TMP 和磺胺類藥物聯(lián)合使用可以更加有效的起到殺菌、抑菌的作用，但同時(shí)也產(chǎn)生了賦予TMP 抗性的dfr基因。根據(jù)dfr基因的尺寸和結(jié)構(gòu)將其分為兩大類：dfrA和dfrB[21]。

在遼寧、貴州、福建、廣東、江西和江蘇等地區(qū)都檢測(cè)出了sul1、sul2和sul3[22-25]。無論在豬源還是禽源中，sul2的檢出率最高超出70%，sul1次之，sul3只在部分地區(qū)檢出率最高，而dfrA和dfrB的檢出率相對(duì)較低。

5 四環(huán)素類

四環(huán)素類藥物是廣譜抗菌藥，在臨床中被廣泛用于治療人和動(dòng)物的細(xì)菌性感染，在一些國(guó)家常被用作動(dòng)物促生長(zhǎng)劑。四環(huán)素與細(xì)菌的核糖體結(jié)合，從而干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的翻譯來發(fā)揮抗菌藥的作用，其外排泵蛋白和降解酶的出現(xiàn)使得細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性[26]。

根據(jù)四環(huán)素耐藥基因命名中心（https://faculty.washington.edu/marilynr/）發(fā)布的信息可知，在大腸桿菌中存在13 種四環(huán)素耐藥基因：分別是9 種四環(huán)素外排基因tet（A）、tet（B）、tet（C）、tet（D）、tet（E）、tet（G）、tet（J）、tet（L）和tet（Y），3 種核糖體保護(hù)蛋白基因tet（M）、tet（W）和tet（32）和1 種編碼氧化還原酶使四環(huán)素失去活性的基因tet（X）。在近年國(guó)內(nèi)的報(bào)道中，前兩種機(jī)制是細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗菌藥產(chǎn)生耐藥性的主要因素。

四環(huán)素耐藥基因的廣泛分布與其通過質(zhì)粒傳播的方式密切相關(guān)。程于夢(mèng)等[27]在雞源葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了攜帶cfr與tet（M）基因的質(zhì)粒STR-9，荊煒[28]在肺炎克雷伯菌和大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)tet（A）基因突變體都位于質(zhì)粒上。另外，有研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥基因往往不是單獨(dú)存在，多種并存的情況更為常見。研究人員對(duì)783 株大腸桿菌所攜帶的基因類型數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)4重?cái)y帶最多（34.2%），其次是3 重（21.1%）和5 重（26.4%）；并且米諾環(huán)素和替加環(huán)素的耐藥性與基因攜帶數(shù)量有一定關(guān)聯(lián)，攜帶5 重和6 重基因的耐藥率明顯比其他重?cái)?shù)的高[29]。

6 酰胺醇類

酰胺醇是一種廣譜抗菌藥物，其非氟化（如氯霉素）和氟化（如氟苯尼考）衍生物已用于獸醫(yī)學(xué)。目前在動(dòng)物中使用非氟化苯酚僅限于治療伴侶動(dòng)物和寵物，但氟化衍生物氟苯尼考已被批準(zhǔn)用于治療生產(chǎn)食品動(dòng)物的細(xì)菌感染。耐藥菌對(duì)氟苯尼考產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要是通過特異/非特異的外排泵基因編碼的外排泵系統(tǒng)使細(xì)菌獲得耐藥性[30]，其中以floR、fexA和fexB在各類耐藥菌株中普遍流行。

高懿等[31]在111 株氟苯尼考耐藥的豬源屎腸球菌中，檢測(cè)出fexB、fexA、floR的攜帶率分別為58.56%、27.03%和17.12%；劉艷紅等[32]對(duì)豬源和雞源的氟苯尼考耐藥大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中61.2%含有floR基因；陳紅梅等[33]對(duì)分離自福建、廣東和江西的113 株禽源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)floR的檢出率為64.04%（72/113）；吳方達(dá)[34]對(duì)不同菌屬的floR基因進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)菌間的floR存在高度同源性。這些研究表明floR廣泛存在于不同細(xì)菌間，且可在不同細(xì)菌間進(jìn)行水平傳播。

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)，耐藥基因cfr、fexA和fexB的傳播與插入序列IS21-558 和Tn558 轉(zhuǎn)座酶基因有相關(guān)性[35-36]；張平等[37]在豬源腸球菌氟苯尼考耐藥性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，fexA基因存在于Tn554 結(jié)構(gòu)中。由此可見，養(yǎng)殖動(dòng)物中酰胺醇類耐藥基因以氟苯尼考耐藥基因流傳最廣、影響最大，其在不同菌種間的普遍流行與移動(dòng)元件的水平傳播密切相關(guān)。

7 黏菌素

黏菌素是一種針對(duì)革蘭氏陰性菌外膜脂多糖的多肽類抗菌藥物，被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)學(xué)，主要用于治療或預(yù)防腸道感染。目前認(rèn)為黏菌素的抗菌機(jī)制可能與編碼革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）修飾酶的基因有關(guān)，操縱子pmrCAB編碼3 種蛋白質(zhì)，即磷酸化乙醇胺磷酸轉(zhuǎn)移酶PmrC、反應(yīng)調(diào)節(jié)劑PmrA（也稱為BasR）和傳感器激酶蛋白PmrB（也稱為BasS）[38]。另外，有研究認(rèn)為PhoPQ 雙組分系統(tǒng)或其調(diào)節(jié)因子MgrB 的突變與黏菌素抗性有關(guān)。近年來國(guó)內(nèi)學(xué)者還證明mcr-1的編碼產(chǎn)物參與脂質(zhì)A 的磷酸乙醇胺修飾，從而降低了黏菌素和細(xì)菌的靜電作用，干擾了兩者的結(jié)合效率，最終使細(xì)菌獲得了耐藥表型[39]。

Liu 等[39]從2013 年收集的上海某豬場(chǎng)的動(dòng)物源菌株中首次報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1。當(dāng)前導(dǎo)致mcr-1流行的主要原因在于質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播方式。該耐藥機(jī)制導(dǎo)致黏菌素耐藥菌株在近幾年明顯增多。易靈嫻等[40]研究發(fā)現(xiàn)，mcr-1基因主要位于IncX4、Incl2、IncHI1、IncHl2、IncP、IncF 和IncF I Ⅱ型質(zhì)粒上。李振斌等[41]選取2008—2015年采集的18 203 株大腸埃希菌和2009—2015 年采集的1 729 株沙門菌為研究對(duì)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mcr-1總體檢出率較低，但呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。該基因主要引起MIC=4 μg/mL 的低水平耐藥且主要在大腸埃希菌中被檢出。目前mcr-1陽性菌在國(guó)內(nèi)的豬、禽養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛流行，并且mcr-1基本都在腸桿菌科細(xì)菌中被檢出。在黏菌素耐藥基因中，mcr-1擁有多達(dá)7 種變體。除了國(guó)內(nèi)最為流行的mcr-1，還有被陸續(xù)報(bào)道的mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5。

8 小結(jié)

當(dāng)前國(guó)內(nèi)耐藥形式不容樂觀，細(xì)菌對(duì)各類抗菌藥均有不同程度的耐藥，且耐藥基因的種類繁多，在國(guó)內(nèi)分布廣泛，涉及的動(dòng)物種類包含家禽、大型牲畜以及伴侶動(dòng)物，在養(yǎng)殖場(chǎng)中主要以豬源和禽源菌株中的耐藥基因檢出率高。流行率和檢測(cè)率較高的耐藥基因多數(shù)能在質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)元件上被檢出，并以水平傳播方式進(jìn)行擴(kuò)散。不僅如此，許多耐藥性調(diào)查顯示，在同一個(gè)質(zhì)粒上檢測(cè)出數(shù)種耐藥基因。這些攜帶多種耐藥基因的質(zhì)粒是細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥現(xiàn)象的重要原因。耐藥菌株以及多重耐藥菌株會(huì)給畜牧養(yǎng)殖造成巨大損失，并使得養(yǎng)殖動(dòng)物成為耐藥菌株不斷增殖的“溫床”。雖然耐藥菌株可以在禽畜食品加工的過程中被殺滅，但是耐藥基因依舊會(huì)殘留在禽畜食品中，最終直接威脅到人類的健康安全。面對(duì)目前的耐藥現(xiàn)狀，我國(guó)政府部門已陸續(xù)出臺(tái)了多項(xiàng)應(yīng)對(duì)方案。通過實(shí)施遏制細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃，提高養(yǎng)殖技術(shù)和做好生物安全防護(hù)，減少抗菌藥使用，逐步走向“無抗養(yǎng)殖”模式，從根源上減少耐藥基因的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的條件，從而改善國(guó)內(nèi)的細(xì)菌性耐藥現(xiàn)狀。