李明月，李 響，鄒 偉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

自噬來(lái)源于希臘語(yǔ)，早在50多年前，自噬現(xiàn)象就被美國(guó)科學(xué)家T. P. Ashford和K. R. Porter通過(guò)電子顯微鏡在大鼠肝臟細(xì)胞中觀察到[1]。自噬在生理、病理上的重要功能逐漸被人類(lèi)認(rèn)識(shí)[2]。

1 自噬

1.1 經(jīng)典自噬

自噬一般可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬[3]，前兩者清除蛋白底物均無(wú)選擇性，而分子伴侶介導(dǎo)的自噬要求被降解的蛋白底物必須都含有特定的氨基酸序列，且能被HSC73識(shí)別并結(jié)合[4]，進(jìn)而被降解。通常自噬過(guò)程分為自噬前體的形成、自噬小體的形成、自噬溶酶體形成3個(gè)階段[5]。

1.2 經(jīng)典自噬過(guò)程及分子調(diào)控機(jī)制

參與自噬的重要分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)上有幾個(gè)重要的區(qū)域，分別為激酶區(qū)、FAT區(qū)、FATC區(qū)、HEAT重復(fù)序列區(qū)、FRB區(qū)。其中激酶區(qū)能夠接受自噬起始信號(hào)，F(xiàn)AT區(qū)和FATC區(qū)可以調(diào)節(jié)mTOR激酶的活性。在酵母細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)TOR激酶與Atg1結(jié)合，將其磷酸化成PAtg1,從而抑制自噬相關(guān)的下游信號(hào)；相反在饑餓狀態(tài)時(shí)，TOR激酶被抑制，Atg1去磷酸化，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[6]。

1.2.1 自噬前體形成階段 自噬調(diào)控基因 Atg6 /Beclin1主要參與這個(gè)階段。Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(ClassⅢPI3K)是影響其活性的重要激酶。ClassⅢPI3K的催化亞基Vps34與Atg6/Beclin1的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可以催化質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇為磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P)，PI3P可以組裝含有PX和FYVE結(jié)構(gòu)域的蛋白到自噬發(fā)生的位置，參與自噬前體膜形成[7]。

1.2.2 自噬小體形成階段 該階段需要Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)和Atg8/LC3連接系統(tǒng)參與。前者主要定位于自噬體外膜，后者在自噬體內(nèi)膜和外膜都有定位。在Atg5-Atg12-Atg16的連接系統(tǒng)中，在類(lèi)E1泛素激活酶和類(lèi)E2泛素結(jié)合酶的誘導(dǎo)下，Atg12經(jīng)由Atg7和Atg10最終傳遞至Atg5，形成Atg5-Atg12復(fù)合物，同時(shí)Atg16的低聚物可以與大量的Atg5-Atg12復(fù)合物連接，形成更大的復(fù)合物，并連接在自噬前體雙層膜上使其延長(zhǎng)[8]。在Atg8/LC3連接系統(tǒng)中，LC3最初是以LC3-I的形式存在，處于一種非活化狀態(tài)，在自噬出現(xiàn)時(shí)，LC3-I被Atg7和Atg3依次活化，在Atg5-Atg12-Atg16連接系統(tǒng)的協(xié)助下與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合，轉(zhuǎn)化成具有膜結(jié)合能力的活化的LC3-II，共同參與雙層膜的延長(zhǎng)和自噬小體的形成[9]。

1.2.3 自噬溶酶體形成階段 相對(duì)于自噬早期階段，該階段的機(jī)制研究較少。首先自噬小體成熟后，大部分Atg蛋白從自噬小體外膜脫落，而LC3-II繼續(xù)停留于內(nèi)膜上。最后自噬小體外層膜成功與溶酶體膜融合形成自噬溶酶體，自噬小體內(nèi)層膜連同被降解底物一同在溶酶體中被降解[10]。

2 自噬在腦出血中的作用

2.1 腦出血中影響自噬的主要因素

腦出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)是一種破壞性的中風(fēng)，導(dǎo)致世界范圍內(nèi)的高死亡率和高致殘率。近幾年越來(lái)越多的研究證明自噬在腦出血后的病理?yè)p傷中發(fā)揮了重要作用。早在2008年，HeY等[11]在實(shí)驗(yàn)大鼠基底節(jié)自體血注入3天和7天后，利用電鏡在血腫周邊的組織細(xì)胞內(nèi)觀察到自噬小體結(jié)構(gòu)，首次證實(shí)了在 ICH 發(fā)生后自噬的激活。Ren C等[12]運(yùn)用神經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)方法(LC-MS/MS)研究在ICH大鼠模型腦損傷后蛋白質(zhì)的差異表達(dá),證明了出血性腦卒中蛋白確實(shí)參與了自噬過(guò)程。

ICH發(fā)生后紅細(xì)胞裂解，大量游離鐵釋放。為了研究鐵對(duì)腦出血后的神經(jīng)損傷是否與自噬相關(guān)，有學(xué)者做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。在體內(nèi)，通過(guò)對(duì)大鼠右側(cè)海馬體內(nèi)分別注射生理鹽水和亞鐵進(jìn)行觀察；在體外，將大鼠胚胎的原始培養(yǎng)皮層神經(jīng)元暴露于亞鐵中。并在1、3、7天內(nèi)對(duì)LC3進(jìn)行了Western blot分析和MDC染色。結(jié)果在體內(nèi)和體外均有LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II。MDC標(biāo)記顯示，將神經(jīng)元暴露在鐵元素中，會(huì)出現(xiàn)MDC的積累,說(shuō)明腦出血后鐵的積累可以誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，參與腦損傷[13]。有研究也支持這一觀點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)大鼠大腦的自噬細(xì)胞死亡中，檢測(cè)到鐵含量增加[14]。另外，凝血酶也可在腦出血后大量釋放，并彌散至血腫周?chē)Ｑ芯勘砻髟谂囵B(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，凝血酶增強(qiáng)了LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化，并增加了MDC標(biāo)記的自噬液泡[15]。腦出血后周?chē)M織由于血腫、水腫形成，占位效應(yīng)明顯，周?chē)M織繼發(fā)缺氧，研究表明缺氧可以通過(guò)激活缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)的途徑來(lái)影響自噬在慢性和中度缺氧中產(chǎn)生，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的清除起到保護(hù)作用。此外，另外3個(gè)氧敏感信號(hào)通路也與自噬的激活有關(guān)。包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶激酶(mTOR)展開(kāi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)和PKCδ-JNK1通路。此外與自噬的保護(hù)作用相反，在快速和嚴(yán)重的氧波動(dòng)期間，自噬可能是有害的，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]。

自噬的產(chǎn)生不僅與腦出血后的組織病理狀態(tài)有關(guān)，有研究顯示自噬的作用與性別有關(guān)，在探討神經(jīng)元自噬和雌激素介導(dǎo)的保護(hù)作用對(duì)抗鐵紋狀體損傷的關(guān)系過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)檸檬酸亞鐵誘導(dǎo)雌性大鼠的自噬程度以及行為缺陷等均較雄性低[17]。另有研究也支持性別在腦出血作用中的差異[18]。在腦出血后，男性的存活率比絕經(jīng)前的女性要低。自噬不僅與性別有關(guān)，自噬的作用與年齡也有關(guān)，有學(xué)者研究了衰老對(duì)腦出血后自噬的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)老年大鼠與幼齡大鼠相比，LC3-I/LC3-II的轉(zhuǎn)化率在同側(cè)基底神經(jīng)節(jié)中較高。血腫周?chē)M織蛋白酶D水平在老年大鼠中也較高。老年大鼠ICH后神經(jīng)功能缺損較嚴(yán)重，功能恢復(fù)較慢[19]。不僅如此，廖遠(yuǎn)生等[20]針對(duì)腦出血中醫(yī)辨證的不同證型的自噬差異還做了深入研究，發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)閉、陰閉和脫證中自噬泡數(shù)目和自噬相關(guān)蛋白CathepsinD表達(dá)存在顯著差異，且與病情輕重呈正相關(guān)。

2.2 自噬在腦出血中的作用

2.2.1 自噬的破壞作用 自噬是機(jī)體對(duì)環(huán)境變化做出的一種應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)度自噬會(huì)對(duì)細(xì)胞造成破壞；自噬不足，不能有效的清除受損的細(xì)胞器和破碎蛋白也會(huì)對(duì)細(xì)胞功能造成影響。白細(xì)胞介素-33(IL-33)是一種最近發(fā)現(xiàn)的IL-1家族成員，有研究表明 IL-33通過(guò)抑制炎癥、凋亡和自噬作用，在膠原酶誘導(dǎo)的ICH模型中提供神經(jīng)保護(hù)[21]。Yang Z等[22]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體-4(TLR4)可能是參與了自噬的激活，進(jìn)而引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活介導(dǎo)了ICH炎癥損傷。陸夢(mèng)茹等[23]在腦出血與自噬關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)抑制 C57BL/6小鼠的TLR4及自噬可減輕自噬引起的腦出血炎癥損傷。對(duì)于腦出血自噬作用的通路，有專(zhuān)家通過(guò)在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究中證明，自噬在腦出血模型中造成的神經(jīng)損傷可能與NF-κB通路的調(diào)節(jié)有關(guān)[24]。另有研究表明miRNA-144可以通過(guò)mTOR調(diào)控腦出血后誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞自噬和炎癥，造成腦損傷。miRNA-144的下調(diào)可以抑制ICH小鼠的炎癥、腦水腫，改善神經(jīng)功能[25]。除此之外，在治療上，Wu Z等[26]研究發(fā)現(xiàn)在大鼠ICH模型中注射米諾環(huán)素可以顯著減少I(mǎi)CH后腦損傷，根據(jù)注射米諾環(huán)素后beclin1、LC3II/I、caspase-3/8均被抑制，推測(cè)其保護(hù)作用與抗自噬和抗凋亡有關(guān)。Chang P等[27]在研究中還首次證明了抗壞死性凋亡的抑制劑-1能夠抑制細(xì)胞凋亡和自噬，從而發(fā)揮ICH后神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究證實(shí)了自噬在ICH中的破壞作用，并指出有效的抑制自噬，可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2.2 自噬的保護(hù)作用 自噬是一種溶酶體參與的細(xì)胞代謝途徑，自噬的適度激活可使受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被降解和回收，以維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)。據(jù)研究證實(shí)，腦出血后可產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而激活自噬，吞噬氧化應(yīng)激產(chǎn)物，減輕ICH后腦損傷[28]。另有研究表明可以通過(guò)BECN1和ATG5激活小膠質(zhì)細(xì)胞自噬為ICH提供保護(hù)作用[29]。不僅如此，有文章顯示自噬的保護(hù)作用，與大腦損傷的不同部位有關(guān)[30]，有學(xué)者利用腦卒中的動(dòng)物模型，評(píng)估自噬在大腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)保護(hù)作用[31]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)和大腦皮層之間的自噬標(biāo)記存在顯著差異。在造模后的3 h內(nèi)，自噬體和自噬通量在大腦皮層中有所增加。在海馬區(qū)未觀察到明顯增加。仇志富等[32]利用補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌藥研究自噬在腦出血中的作用發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)CXCR4-PI3K信號(hào)通路激活自噬，起到腦保護(hù)作用。

3 針刺對(duì)腦出血自噬過(guò)程的雙向調(diào)節(jié)作用

針刺作為一種綠色有效的治療手段，已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。世界衛(wèi)生組織推薦針灸作為改善中風(fēng)治療的替代和補(bǔ)充策略[33]。關(guān)于針刺對(duì)自噬的影響，Luo D等[34]廣泛搜索了PubMed、Embase、Science和CNKI,結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺對(duì)動(dòng)物模型的自噬具有潛在的治療作用。Li HQ等[35]對(duì)于針刺選穴百會(huì)治療急性腦出血?jiǎng)游锬Ｐ妥隽饲罢靶缘幕仡櫤退C萃分析，最后得出，針刺百會(huì)是治療急性腦出血的一種可選治療方法。Liu H等[36]利用頭針進(jìn)行針刺，發(fā)現(xiàn)頭針治療可降低TNF-α和NF-κB 的表達(dá)，改善腦出血大鼠神經(jīng)功能缺陷。牛明明等[37]采用自體血注入法制作腦出血大鼠模型，利用“百會(huì)”透“曲鬢”針刺法對(duì)其進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白LC3A/B在針刺組表達(dá)最高，且針刺組神經(jīng)功能改善最明顯，提示頭穴透刺可以促進(jìn)自噬作用，參與神經(jīng)修復(fù)。包宇等[38]觀察針刺“百會(huì)”透“曲鬢”對(duì)腦出血急性期大鼠P13K和P-AKT表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)針刺可以提高兩種蛋白表達(dá)水平，減輕腦出血后繼發(fā)性損傷。鄒偉等[39]研究發(fā)現(xiàn)頭針透穴法可能對(duì)β-catenin表達(dá)有作用，進(jìn)而激活 Wnt信號(hào)通路參與自噬。Niu M等[40]針對(duì)ICH后自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)做了相關(guān)性研究，得出自噬能夠在ICH后清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的錯(cuò)誤蛋白聚集，對(duì)細(xì)胞提供保護(hù)作用。而早期研究已經(jīng)證實(shí),PERK通路是激活自噬相關(guān)基因誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的主要通路之一[41]。相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對(duì)針刺在實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血模型中自噬作用影響做了進(jìn)一步研究得出，隨著大鼠腦組織損傷加重，PERK蛋白表達(dá)增加，自噬作用增強(qiáng)，而針刺“百會(huì)”透“曲鬢”可以明顯緩解3-MA抑制劑對(duì)自噬的抑制作用和對(duì)PERK通路活躍度減低情況[42]。進(jìn)一步驗(yàn)證針刺治療可以通過(guò)激活PERK通路激活自噬，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)。以上研究均說(shuō)明針刺可以適度激活自噬起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

另外針刺也可以適度抑制自噬發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Li HQ等[43]研究發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)穴治療腦出血可以通過(guò)干擾Caveolin-1介導(dǎo)的分子途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Caveolin-1已被證明參與自噬途徑[44]。另外Zou W等[45]發(fā)現(xiàn)針刺抑制腦出血大鼠基底神經(jīng)節(jié)Notch1和Hes1蛋白表達(dá)，參與腦神經(jīng)保護(hù)。Notch1被證明可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[46]。Li X等[47]研究證實(shí)芬戈莫德通過(guò)mTOR/P70S6k途徑抑制自噬過(guò)度激活，可以緩解腦缺血再灌注損傷,證明了mTOR/P70S6k途徑對(duì)于自噬的負(fù)性調(diào)控作用。而詹谷文[48]在腦出血大鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)，電針聯(lián)合BMSCs移植治療可以激活mTOR/P70S6k信號(hào)通路,提高突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù);為針刺抑制腦出血后自噬作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。張國(guó)威等[49]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)針刺“百會(huì)”透“曲鬢”可能在腦出血急性期通過(guò)抑制內(nèi)源性 MMP-9表達(dá)的途徑發(fā)揮拮抗腦損傷作用。Li WD等[50]在研究二甲雙胍抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中證明，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9可以通過(guò)AMPK/mTOR自噬途徑降低。而針刺對(duì)腦出血腦損傷的拮抗作用，是否通過(guò)影響了自噬途徑從而抑制MMP-9的產(chǎn)生，還有待于進(jìn)一步研究。姜桂美等[51]在ICH急性期運(yùn)用針刺進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)果針刺顯著降低了血腫腦組織周?chē)仔约?xì)胞因子IL-1β 與 IL-6的表達(dá),減輕了對(duì)腦組織的繼發(fā)性損傷。Zhao X等[52]研究發(fā)現(xiàn)臭氧在大鼠軟骨細(xì)胞中刺激IL-1β產(chǎn)生可以激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路誘發(fā)自噬;為IL-1β與自噬之間的關(guān)系提供了依據(jù)，也為針刺抑制IL-1β誘導(dǎo)的自噬提供了理論基礎(chǔ)。

4 討論

腦出血是中風(fēng)的一種亞型，其發(fā)病機(jī)制和治療手段已被廣泛研究。自噬作為細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，在ICH中的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)。但研究相對(duì)較少，自噬對(duì)ICH后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用還有待于進(jìn)一步探討，在ICH病理?yè)p傷的不同階段和不同影響狀態(tài)下，自噬所發(fā)揮的作用可能不是單一性質(zhì)的。正如Duan XC等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在ICH后6 h,過(guò)度的自噬參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腦組織損傷，而在ICH后7天，自噬可能通過(guò)清除早期自噬通量損傷產(chǎn)生的代謝廢物，發(fā)揮腦保護(hù)作用。所以動(dòng)態(tài)觀察腦出血后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)變化能更好的闡明自噬的作用。另外自噬是一把雙刃劍[54]，如何適度的激活自噬發(fā)揮自體修復(fù)作用仍然很模糊，過(guò)度自噬不僅不能有效清除受損蛋白，還會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。但目前研究對(duì)于干預(yù)自噬程度的探討不足，缺乏可供參考的文獻(xiàn)。針刺在治療ICH過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。針刺可以直接影響自噬過(guò)程，也可以通過(guò)激活炎癥因子、腫瘤壞死因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路等其他機(jī)制間接干預(yù)自噬。盡管在實(shí)驗(yàn)研究中針刺治療ICH已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但目前針對(duì)自噬這一作用機(jī)制，探討針刺對(duì)ICH治療作用的研究甚少。已有研究也多集中在對(duì)某一自噬相關(guān)基因或蛋白的影響，缺乏針對(duì)自噬經(jīng)典通路或線粒體自噬等選擇性自噬的研究。針刺的良性雙向調(diào)節(jié)與自噬的正面和負(fù)面作用的關(guān)系如何體現(xiàn)，針刺如何調(diào)節(jié)自噬穩(wěn)態(tài)，仍然存在疑惑。

針刺作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分在腦出血治療上療效顯著，關(guān)于針刺良性調(diào)節(jié)腦出血后自噬穩(wěn)態(tài)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞自體修復(fù)這一重要作用希望能通過(guò)后續(xù)大量研究更好的闡明。同時(shí)更應(yīng)該增加實(shí)驗(yàn)研究手段，不能單純局限于western blot、PCR等，為臨床針刺治療腦出血效果顯著提供更加深刻的理論支持。自噬在腦出血中作用研究可以為臨床腦出血的治療提供新的方向。