孫珂煥 朱曉峰 楊麗 王攀攀 李小云 張榮華*

1.暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632 2.暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632 3.暨南大學附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630 4.暨南大學腫瘤研究所，廣東 廣州 510632

隨著人口老齡化的加速，骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率逐年增高[1]。最新數(shù)據(jù)顯示，我國的患病人數(shù)已達1.4億[2]，骨質疏松性骨折發(fā)病率不斷增高，嚴重危害老齡人口的生活質量[3]。OP發(fā)病的根本原因在于骨吸收與骨形成的失衡，而目前防治多以抑制骨吸收的藥物為主，雖然抑制了骨改建過程，但難以恢復已丟失的骨量，且存在諸多不良反應[4]。因此如何促進骨形成是近年來研究的熱點[5]，同時探討其相關分子生物學機制，對預防和治療骨質疏松具有重大意義[6]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)廣泛存在于多種組織和器官中，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞。其中骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC)研究最為廣泛深入，其分化去向在骨代謝中扮演了重要角色，外部因素及其信號處理過程如何調控其分化去向是當前研究的熱點[7]。目前學者們已從胞內信號轉導通路、基因轉錄及轉錄后水平調控開展了大量研究，但決定BMSC分化的關鍵步驟與因子仍屬深入探索的領域[8]。

外泌體(exosome)作為細胞間信號通訊的重要途徑，也是干細胞最重要的旁分泌形式[9]，在BMSC間的信號傳遞并影響其分化走向方面扮演十分重要的角色。近年來研究表明細胞間的交流會對骨形成產(chǎn)生很大的影響[10]，外泌體能通過信號蛋白、miRNA 等方式調控BMSC增殖和分化，也有研究發(fā)現(xiàn)BMSC來源的外泌體可以通過調控宿主BMSC的成骨分化功能改善骨質疏松[11-12]，其在骨質疏松的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本文現(xiàn)就BMSC來源的外泌體在OP中的研究進展進行綜述。

1 外泌體的生物學特性

1.1 外泌體的概述

外泌體是由多種細胞分泌到胞外的納米級膜性泡，直徑約為30～100nm[13]，密度在1.13～1.21 g/mL，具有雙層脂質膜結構[14]，成杯型或球狀[15]，廣泛分布于血液、尿液、唾液、乳汁等多種體液中。含有蛋白質、脂類、mRNA、miRNA、細胞因子和轉錄因子受體等多種生物活性物質[16]，能作為信號分子傳遞給靶細胞，從而介導細胞間的物質傳遞與信息交流。

1.2 外泌體的形成

外泌體起源于胞內體途徑[17]，其中最經(jīng)典的途徑是內吞體運輸分揀復合物(endosomal sorting complexs required for transport，ESCRT)。細胞膜表面的跨膜蛋白被吞噬形成初級核內體，初級核內體與細胞內吞的囊泡融合，將囊泡中回收、退化或胞外分泌的部分吸收成為次級核內體后，ESCRT-0 復合體會結合泛素化蛋白，形成的ESCRT-I和ESCRT-II會調節(jié)腔內的小泡芽，形成的多泡體(multivesicular body，MVB)既可以被溶酶體降解，也可以通過胞吐作用將腔內的小泡釋放到胞外空間形成外泌體。

1.3 外泌體的組成

外泌體含有豐富的蛋白質，其中一類非特異性表達包括四分子交聯(lián)跨膜蛋白超家族(CD9、CD63、CD81、CD82)、 Alix、TSGl01和熱休克蛋白等，可作為識別外泌體的蛋白標志物[18]。另一類是具有細胞源性的特異性蛋白質，如T細胞來源的外泌體攜帶有CD3分子[19]，破骨細胞源性的外泌體內含核因子-kb受體活化因子(RANK)[20]，這類蛋白質可能與細胞信號轉導功能相關，在不同的生理病理條件下有表達的差異，具備生物學標志物的潛力，對疾病的診斷有重要意義。

外泌體包含的另一大類重要物質為核酸，包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等，在細胞間的遺傳物質信息傳遞過程中發(fā)揮重要作用，可調控生物信息，參與調節(jié)多種生理和病理過程[21]。在這些分子中，miRNA在基因表達方面的調控最受關注，其比例在外泌體中比母細胞更高[22]，且有研究表明，miRNA不是隨機整合進入外泌體，而是母細胞具有的一種分類機制引導特定的細胞內miRNA進入外泌體[23]。

1.4 外泌體的生物學功能

外泌體的特異性功能與所含的蛋白質、核酸及所處的微環(huán)境密切相關，其發(fā)揮作用是通過內分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞，與靶細胞膜融合或內吞作用將信息傳遞給細胞進而行使生物學功能[24]?，F(xiàn)階段認為外泌體產(chǎn)生生物學效應的方式主要有：一是外泌體表面的蛋白分子或脂質配體直接激活靶細胞表面的受體，產(chǎn)生信號復合體并激活胞內信號通路；二是外泌體可以與靶細胞的質膜融合或內吞直接進入細胞，將自身攜帶的蛋白質、核酸、脂質等活性分子帶到細胞內，激活靶細胞內相關信號通路，進而調控細胞的功能及生物學行為[25]。

2 BMSC外泌體在骨質疏松中的作用

2.1 外泌體參與BMSC的骨向分化

近年研究發(fā)現(xiàn)，外泌體在細胞成骨分化中具有重要作用，BMSC來源的外泌體可以促進成骨細胞(osteoblast，OB)的增殖和分化，提示它在骨修復或骨組織再生中的潛能[26]。有研究表明，抑制細胞Rab27a(外泌體釋放啟動因子)表達后，明顯抑制了體外BMSC的成骨分化作用，而在培養(yǎng)體系中補充BMSC來源的外泌體則可以促進細胞的成骨分化作用[27]。Narayanan等[28]在探討外泌體對成骨分化作用的研究中也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，同時發(fā)現(xiàn)從前成骨細胞MC3T3-E1中提取分離的外泌體可以促進BMSCs分化成OB，對胞內miRNAs的表達有顯著的影響，而這些變化是通過激活Wnt信號通路來促進成骨分化。

目前也有研究顯示，除了BMSC來源的外泌體，其他一些特定細胞或組織來源的外泌體可促進BMSC的成骨分化，但具體機制尚未闡明。Ekstrtom等[29]發(fā)現(xiàn)，人單核細胞分泌的外泌體對BMSC具有促成骨分化作用，該類外泌體與BMSC共培養(yǎng)后，其細胞表面的骨標志基因Runx2、BMP-2的表達與對照培養(yǎng)基相比均顯著增加。人樹突細胞來源的外泌體同樣可以促進人BMSC向OB分化[30]，經(jīng)作用后的BMSC堿性磷酸酶(ALP)的活性增高，Runx2表達升高，其促成骨分化作用可能與其內含有大量與成骨分化相關的基因和蛋白有關。因此，外泌體促進BMSC成骨分化的具體分子機制，仍需進一步研究證實。

2.2 BMSC外泌體miRNA參與調控BMSC的骨向分化

BMSC分泌的外泌體中含有多種miRNA[31]，并參與調控BMSC的成骨分化功能。因其在基因表達調控中的關鍵作用，外泌體miRNA的功能已經(jīng)成為研究的焦點[32]。最近的研究揭示了許多參與骨骼重塑調控的骨源性外泌體miRNA，包括miR-30 d-5p、miR-133b-3p、miR-140-3p等43個miRNA在MC3T3-E1外泌體中高表達，這些miRNA可能參與到成骨細胞分化和功能的多種途徑中，如Wnt、TGF-β和鈣信號通路[33]。

人BMSC在成骨分化的不同階段中，其分泌的外泌體miRNA表達譜亦隨之改變，其中l(wèi)et-7a、miR-135b、miR-148a、miR-199b、miR-203、miR-218、miR-219、miR-299-5p、miR-302b在成骨分化過程中顯著上調，而miR-155、miR-181a、miR-221、miR-320c、miR-885-5p顯著下調，且Wnt通路信號分子的富集與成骨相關的外泌體miRNA差異化分布同步，這表明BMSC分泌的外泌體miRNA調控其成骨分化功能[34]。Qin等[35]的研究顯示，人BMSC來源的外泌體通過內吞作用進入成骨細胞內并傳遞成骨相關的miRNA，其中miRNA-196a對調節(jié)成骨ALP、OCN、Runx2的表達及對成骨細胞的活性和分化具有正向調控作用，予以BMSC來源的外泌體對顱骨缺損大鼠進行骨形成刺激，能促進骨缺損處新骨再生和血管生成。BMSC來源的外泌體miRNA在骨代謝平衡起重要調節(jié)作用，未來仍需要進一步探討多種miRNA對OP的影響，以通過調控外泌體中多種miRNA的表達提高治療OP的作用。

2.3 外泌體與成骨細胞

成骨細胞起源于BMSC，是骨形成的主要功能細胞，負責骨基質的合成、分泌和礦化。Ge等[36-37]在研究成骨細胞外泌體并探索其潛在功能時，分離提取小鼠MC3T3外泌體并進行蛋白質組學分析，確定了1 536種蛋白質，其中172種蛋白質與骨骼數(shù)據(jù)庫重疊，基因本體分析顯示外泌體主要參與蛋白質的定位和胞內信號傳導，蛋白質網(wǎng)絡分析顯示與骨骼肌系統(tǒng)發(fā)育和功能、發(fā)育障礙、遺傳障礙和骨形成相關，其中EFNB1、轉化生長因子受體3、LRP6、骨形態(tài)蛋白受體1、SMURF1和真核起始因子2在成骨形成中起著重要的作用，這些外泌體來源的有價值的蛋白可能為骨質疏松研究提供了新的前景。

也有研究發(fā)現(xiàn)，前成骨細胞MC3T3-E1細胞中提取分離的外泌體可以促進骨髓基質細胞(ST2)分化成成骨細胞，同時對胞內miRNA的表達有顯著的影響，而這些變化是通過引起Axinl表達抑制及β-cateninn表達增強來激活Wnt信號通路來促進成骨分化[38]。這些發(fā)現(xiàn)均提示了外泌體介導骨細胞微環(huán)境中細胞間的交流模式及骨重建機制。

2.4 BMSC外泌體與骨質疏松

研究顯示，BMSC外泌體可有效改善骨質疏松癥狀，促進BMSC增殖、成骨分化及骨再生。 Furuta等[39]應用CD9-/-小鼠建立骨折延遲愈合的動物模型，小鼠的骨愈合率明顯低于野生型小鼠，而注射BMSC來源的外泌體能夠促進軟骨內成骨，加速骨折愈合，注射缺乏外泌體的培養(yǎng)基則未出現(xiàn)這種情況。葉慶元等[40]注射小鼠來源的供體BMSC，能夠通過供體BMSC分泌外泌體轉運miR-26恢復雌激素缺乏骨質疏松模型小鼠的BMSC功能并緩解骨質疏松，為研究如何緩解與治療激素水平下調所造成的骨質疏松提供有一定的參考價值。另有研究報道，miR-31水平在老年人和骨質疏松癥患者的血漿中顯著升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，衰老內皮細胞來源的外泌體分泌的miR-31被BMSC攝取，從而抑制間充質干細胞的成骨分化，介導骨質疏松的發(fā)展。血漿外泌體來源的miR-31在骨質疏松的發(fā)病機制中發(fā)揮作用，可能是一種有價值的骨質疏松的生物標志物，可作為骨質疏松新的治療靶點[41]。

此外，Liu等[42]研究表明正常BMSC分泌的外泌體可調控系統(tǒng)紅斑狼瘡所致的骨質疏松表型小鼠BMSC功能，增加小鼠的股骨密度，促進骨再生，改善狼瘡所致骨質疏松癥狀況，機制研究顯示由BMSC分泌的外泌體可將Fas蛋白轉移至模型小鼠BMSC內，降低了細胞內miR-29b的水平，導致Dnmt1介導的Notch1啟動子低甲基化的恢復。研究結果揭示了通過BMSC外泌體提供的Fas蛋白可調節(jié)miR-29b/Dnmt1/Notch表觀遺傳級聯(lián)來改善BMSC功能。Qi等[43]研究人類誘導多能干細胞來源的間充質干細胞分泌的外泌體(exosomes secreted by mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells, hiPSC-MSC-Exos) incorporateHiPSC-MSC-Exos)在體外對去卵巢大鼠來源的BMSC增值和分化的影響，hiPSC-MSC-Exos可增強BMSC的增殖和ALP的活性，上調成骨細胞相關基因的mRNA和蛋白表達水平；進一步體內實驗在骨質疏松合并顱骨缺損大鼠模型中驗證，其外泌體能顯著促進骨缺損處新骨再生和血管生成，且hiPSC-MSC-Exos的效果隨著水平的增加而增加，這些作用的機制可能是通過外泌體內所包含的功能性蛋白、脂質、mRNA、miRNA釋放作用于目的細胞所介導的，為骨質疏松的進一步研究和臨床治療提供了新的思路和方法。

3 BMSC外泌體在骨質疏松中的應用前景和展望

MSC在生理或病理條件下產(chǎn)生的外泌體是細胞間通信的中心介質，通過將蛋白質、脂質、mRNA等傳遞給臨近或遠處細胞，形成了一種全新的細胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進程密切相關[20]。且在各種疾病模型中驗證它們的功能與MSCs相似，在生物體內如修復組織損傷、抑制炎癥反應和調節(jié)免疫系統(tǒng)等功能已得到證實[44]，且外泌體具有高穩(wěn)定性、易于儲存、無需增殖、便于定量使用等優(yōu)勢。

隨著生物醫(yī)學的發(fā)展，出現(xiàn)了空前數(shù)量的治療疾病和延緩疾病進程的潛在靶標。然而很多靶標因為藥物在多種類型細胞的胞內無法溶解或迅速被激活而不具有成藥性。而外泌體本身具有藥物載體的屬性可作為一種潛在的藥物載體備受關注，BMSC是目前被認為產(chǎn)生外泌體能力最強的細胞，且適合大量的外泌體的生產(chǎn)，是理想的天然藥物傳輸載體[45]。同時BMSC分泌的外泌體的功能與其相似，但更具有保護和修復作用，又可減輕很多與BMSC移植有關的安全性問題，如組織骨化及鈣化的風險，成瘤性的安全及免疫排斥問題。BMSC來源的外泌體參與BMSC間的信號傳遞并影響其分化走向，尋找外泌體中關鍵調控因素和藥物作用靶點，可成為治療骨質疏松的一種具有良好前景的新型策略。

雖然BMSC來源的外泌體具有良好的應用前景，但是目前應用還處于初期研究階段。盡管在動物模型中已證實外泌體對促進骨形成具有一定的效果，但將外泌體應用于骨質疏松的治療還面臨許多難題。例如如何高效地提取外泌體，保證復雜分類系統(tǒng)規(guī)范和生物活性，同時在動物實驗注射BMSC外泌體的最佳濃度和時間均不明確，及存在如何使其準確定位到靶組織和靶細胞等問題。隨著對外泌體研究的不斷深入，將更系統(tǒng)更準確地了解其與靶細胞之間的信號機制，對疾病的診治和預防具有重要的意義，未來應用前景廣闊。