伍龍果 蔡勁薇 潘吉銘 梁敏

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科， 廣西 南寧 530021

地塞米松(dexamethasone, DEX)等糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)在臨床上應(yīng)用廣泛，長(zhǎng)期或大劑量使用糖皮質(zhì)激素可引起骨量丟失，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)，增加骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致患者致死致殘，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。GIOP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。有研究認(rèn)為，成骨細(xì)胞凋亡是GIOP重要的發(fā)病機(jī)制之一[2]。已知細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有三條，分別是線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，其中線粒體凋亡通路是凋亡的主要途徑[3]。目前，尚無(wú)地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變的相關(guān)報(bào)道。本研究采用不同濃度的地塞米松干預(yù)體外培養(yǎng)SD大鼠的成骨細(xì)胞，檢測(cè)成骨細(xì)胞的凋亡率，觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)和線粒體膜電位的改變，探討地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的分子作用機(jī)制，為臨床防治GIOP提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠(出生<24 h)，不分雌雄，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.2.1試劑：胎牛血清(Lonsera)，低糖DMEM培養(yǎng)基、I型膠原酶 (Gibco)；地塞米松(Selleck)；堿性磷酸酶BCIP/NBT染色試劑盒、JC-1試劑盒(碧云天)；胰蛋白酶、茜素紅S染色液、TritonX-100、DAPI溶液(索萊寶)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司)。

1.2.2儀器：超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司)，CO2培養(yǎng)箱(Scientific公司)，熒光倒置相差顯微鏡(Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，熒光酶標(biāo)儀(Scientific公司)，電鏡(HTACHI公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取出SD乳鼠的顱骨，放入PBS液中，清洗血跡、剔除附著的結(jié)蹄組織。PBS液清洗3次，將清洗干凈的骨片轉(zhuǎn)移至3 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液中，于37 ℃培養(yǎng)箱中消化10 min，用含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，棄上清；骨片轉(zhuǎn)移至5 mL 0.2%的Ⅰ型膠原酶并完全剪碎約1 mm×1 mm×1 mm大小，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化2 h，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；用含10%的胎牛血清、100 mg/L鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀物，接種于0.25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36 h后換液，以后每2天換液一次，連續(xù)消化法純化。待細(xì)胞密度>90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。

1.3.2成骨細(xì)胞鑒定：堿性磷酸酶染色鑒定：取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期成骨細(xì)胞，按細(xì)胞密度1×105/mL接種至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，48 h后棄培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，PBS液洗兩次，95%乙醇固定15 min，按照堿性磷酸酶BCIP/NBT染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行成骨細(xì)胞染色鑒定。

茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色鑒定：連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞21 d后，棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2次，95%乙醇固定15 min，用PBS液洗3次，0.2%茜素紅染色45 min，PBS液沖洗3次，于倒置顯微鏡下拍照觀察。

1.3.3DAPI染色觀察成骨細(xì)胞核的形態(tài)變化：取第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成骨細(xì)胞，消化重懸，按4×104/mL接種于細(xì)胞爬片6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行干預(yù)，24 h后用鑷子夾出細(xì)胞爬片，PBS液洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，棄固定劑，PBS液洗3次，每次10 min。加入15μg/mL 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液常溫避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4透射電鏡觀察成骨細(xì)胞及其線粒體變化：取第2代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞接種至培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞密度達(dá)90%進(jìn)行干預(yù)，24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，用含有0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞至15 mL離心管中，1 000 r/min 離心5 min；加入1 mL PBS并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，1 200 r/min，離心5 min，清洗3次；棄上清，向沉淀中加入4%戊二醛，于4 ℃過(guò)夜，對(duì)樣本進(jìn)行一系列處理后，用透射電鏡觀察細(xì)胞切片并拍照。

1.3.5Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定成骨細(xì)胞凋亡率：將干預(yù)24 h后的細(xì)胞消化、離心、收集、漂洗，加入Binding Buffer 150 μL重懸細(xì)胞。加入Annexin V-FITC 5 μL充分混勻后再加入PI染色液10 μL，室內(nèi)溫度下避光反應(yīng)10 min。最后，向各組細(xì)胞中加入 Binding Buffer定容至500 μL，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.6線粒體膜電位檢測(cè)：取第4代的成骨細(xì)胞，按4×104/mL密度接種于96孔板中，待其密度>90%，加入藥物進(jìn)行干預(yù)24 h，棄培養(yǎng)液，加入JC-1工作液(300 nmol/L JC-1)，于37 ℃孵育20 min，JC-1緩沖液洗滌2次后，加入細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)線粒體膜電位。設(shè)置激發(fā)光為490 nm、發(fā)射光為530 nm檢測(cè)JC-1單體；設(shè)置激發(fā)光為525 nm、發(fā)射光設(shè)為590 nm檢測(cè)JC-1聚合物。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1SD大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的鑒定

圖1 成骨細(xì)胞形態(tài)及染色A：成骨細(xì)胞形態(tài)×40 B:堿性磷酸酶染色×100 C:茜素紅染色 ×100。Fig.1 Morphology and staining of osteoblast

純化后的成骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48 h后，細(xì)胞呈梭行、三角形等不規(guī)則形，可見胞質(zhì)、胞核(圖1 A)。堿性磷酸酶染色后，成骨細(xì)胞胞漿中有許多染成紫黑色顆?；驂K狀沉淀(圖1B)。成骨細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞會(huì)重疊生長(zhǎng)，形成不透明的鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)經(jīng)茜素紅染色呈橙紅色(圖1C)。2.2地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞核影響

采用10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞24 h，DAPI染色后，用熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組成骨細(xì)胞界限清晰，胞質(zhì)完整，胞漿豐富；10-8mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞界限較清晰，無(wú)明顯細(xì)胞核縮小、核裂解，很少發(fā)生凋亡；10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，細(xì)胞核縮小，可見核解體等凋亡現(xiàn)象；與10-6mol/L地塞米松組相比，10-4mol/L組成骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯增多。提示隨著地塞米松的濃度增加，成骨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加。見圖2。

圖2 地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響(×40)A：空白對(duì)照組；B：DEX 10-8mol/L；C：DEX 10-6mol/L；D：DEX 10-4mol/L白色箭頭所指為凋亡細(xì)胞核。Fig.2 Effect of dexamethasone on apoptosis of osteoblasts (×40)

2.3地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞線粒體的影響

采用透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組成骨細(xì)胞中細(xì)胞核形狀規(guī)整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清晰完整；10-8mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞的細(xì)胞核形狀較規(guī)整，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)目較多，線粒體結(jié)構(gòu)較完整，線粒體嵴較清晰，與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞核及線粒體結(jié)構(gòu)變化不明顯；10-6mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞的細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮，核染色質(zhì)致密濃染，凝集于核膜周邊，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集，胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)目較空白對(duì)照組的明顯減少，線粒體腫脹，仍可見線粒體嵴；10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞的細(xì)胞胞核固縮明顯、染色質(zhì)凝集成塊，線粒體大小不一，腫脹明顯，出現(xiàn)大量空泡樣改變，線粒體嵴斷裂(圖3)。

圖3 透射電鏡下觀察地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡的影響A：空白對(duì)照組；B：DEX 10-8mol/L；C：DEX 10-6mol/L； D：DEX 10-4mol/L；A1、B1、C1、D1 標(biāo)尺2 μm，A2、B2、C2、D2標(biāo)尺1 μm；白色箭頭所指為線粒體。Fig.3 Effect of dexamethasone on osteoblasts apoptosis with transmission electron microscope

2.4地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響

采用不同濃度的地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-8、10-6、10-4mol/L組成骨細(xì)胞凋亡率分別為(2.070±0.644)%、(8.340±0.835)%、(32.273±0.870)%，與空白對(duì)照組相比較，10-8mol/L組成骨細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞凋亡率明顯升高，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松組的成骨細(xì)胞凋亡率分別較空白對(duì)照組增加7.240% 和31.173%(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。隨著地塞米松濃度的增加，成骨細(xì)胞的凋亡率也逐漸升高，提示地塞米松可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性(表1)。

表1 地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響Table 1 Effect of dexamethasone on osteoblast apoptosis

注：與空白對(duì)照組相比，aP< 0.05；與10-8mol/L地塞米松組相比，bP<0.05；與10-6mol/L地塞米松組相比，cP<0.05。

2.5地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

采用不同濃度地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-8、10-6、10-4mol/L組F值(即發(fā)生線粒體膜電位下降的細(xì)胞比例)分別為(45.760±2.811)%、(52.533±3.058)%、(63.565±3.107)%，與空白對(duì)照組相比較(45.719±4.076)%，10-8mol/L組成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位無(wú)明顯下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位明顯減低，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松組膜電位分別較空白對(duì)照組降低6.814% 和17.846%(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。隨著地塞米松濃度的增加，成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位逐漸下降，提示地塞米松可誘導(dǎo)線粒體電位減低，呈劑量依賴性(表2)。

表2 地塞米松對(duì)成骨細(xì)胞線粒體膜電位的變化

注：空白對(duì)照組相比，aP< 0.05；與10-8mol/L地塞米松組相比，bP<0.05；與10-6mol/L地塞米松組相比，cP<0.05。

3 討論

GC在臨床上應(yīng)用廣泛，在抗炎、抗休克、抑制免疫等方面發(fā)揮著重要的作用[4]。國(guó)外一項(xiàng)約四萬(wàn)人的流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，約1%～2%的患者長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療[5]。長(zhǎng)期服用地塞米松等糖皮質(zhì)激素，可致內(nèi)源性及外源性GC過(guò)多，引起骨質(zhì)流失和GIOP等不良反應(yīng)[6]。引起這些不良反應(yīng)是由于地塞米松可抑制骨形成，骨形成與成骨細(xì)胞的數(shù)量及變化密切相關(guān)[7]。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期、大劑量的地塞米松可明顯抑制骨形成，導(dǎo)致SD大鼠發(fā)生骨質(zhì)疏松[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期使用GC治療可引起骨組織中成骨細(xì)胞凋亡率增加、成骨細(xì)胞數(shù)量減少。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，大劑量地塞米松可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡[9-10]，但具體的凋亡機(jī)制目前仍不明確。

常用檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法有：①顯微鏡觀察；②熒光標(biāo)記膜蛋白；③流式細(xì)胞術(shù)；④ TUNEL等[11]。透射電鏡可以觀察到細(xì)胞在凋亡不同時(shí)期超微結(jié)構(gòu)的變化，比生化指標(biāo)更敏感，被認(rèn)為是研究細(xì)胞凋亡的經(jīng)典方法[12]。本研究通過(guò)采用透射電鏡觀察成骨細(xì)胞及其線粒體超微結(jié)構(gòu)、檢測(cè)成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化，探討地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制。

DAPI是一種可與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料[13]。對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的變化以判斷細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本研究采用10-8、10-6、10-4mol/L的地塞米松干預(yù)成骨細(xì)胞，DAPI染色結(jié)果顯示，10-6mol/L和10-4mol/L的地塞米松作用于成骨細(xì)胞24 h后，成骨細(xì)胞出現(xiàn)核解體、核固縮等典型的凋亡特征；而10-8mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞凋亡不明顯。我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著地塞米松濃度的增大，成骨細(xì)胞的凋亡率也隨之增高，10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞凋亡率分別較空白對(duì)照組增加0.970%、7.240% 和31.173%，呈劑量依賴性。Liu等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)隨著地塞米松濃度的增高，成骨細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。采用透射電鏡觀察成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著地塞米松濃度的增加，細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)邊集現(xiàn)象明顯，這提示地塞米松可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；同時(shí)隨著地塞米松濃度的增加，成骨細(xì)胞的線粒體腫脹、空泡樣變化增多，提示地塞米松誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡可能與線粒體結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。

線粒體是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的核心細(xì)胞器，線粒體跨膜電位變化與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[15]。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體內(nèi)膜的通透性變化引起線粒體跨膜電位改變[16]。當(dāng)各種凋亡信號(hào)刺激線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降甚至消失，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[17]。國(guó)內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，隨著地塞米松濃度的增加，MC3T3-E1成骨樣細(xì)胞的線粒體膜電位逐漸下降[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著地塞米松濃度的增加，線粒體跨膜電位明顯下降，10-8、10-6、10-4mol/L地塞米松組成骨細(xì)胞線粒體跨膜電位分別較空白對(duì)照組下降0.04%、6.81%、17.85%，提示地塞米松可引起成骨細(xì)胞線粒體膜電位下降，呈劑量依賴性，從而誘導(dǎo)了成骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，10-6mol/L和10-4mol/L地塞米松可誘導(dǎo)SD大鼠體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與線粒體有關(guān)。