謝勇武，曾亞文，譚屬瓊

（1.福建師范大學 閩南科技學院，福建 泉州 362332；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所）

黃酮、γ-氨基丁酸（GABA）及抗性淀粉（RS）是重要的次生代謝物質(zhì)。稻米黃酮類化合物中研究較多的花色苷類物質(zhì)，具有抗癌、益智、抗氧化、降低血清膽固醇和血清脂質(zhì)等功效；GABA是谷氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，在人體代謝中起著重要作用；RS具有熱量低及功能多等特點，常常作為食品的基料，可有效控制糖尿病情，減少熱量的攝取和有效控制體重。冷害是水稻減產(chǎn)的重要原因，水稻各生育時期耐冷性在種間、種質(zhì)之間存在差異。通常情況下，低溫下植株的代謝變慢，植株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物黃酮、GABA及RS等功能成分的量有所不同。GABA在植物體內(nèi)積累與代謝機制與質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白密切相關(guān)，這與水稻耐冷存在一定關(guān)系。育種實踐中，農(nóng)藝性狀是水稻育種的重要指標。本研究對粳稻02428突變體RIL F6家系群糙米RS、GABA、總黃酮含量的遺傳規(guī)律進行分析。同時，利用通徑和逐步回歸分析對各功能物質(zhì)含量與主要農(nóng)藝性狀進行相關(guān)分析，為冷害條件下選育高生物活性成分含量水稻提供參考，也為水稻耐冷選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

重組自交系群體構(gòu)建方法：

1.2 方法

將親本及其F6代種植于云南省農(nóng)業(yè)科學院試驗場（昆明海拔1 916 m，7月22-27日每天14：00實測溫度20.2～13.8℃，自然冷害）。3月25日播種、5月12日移栽。隨機區(qū)組設計，2次重復；插秧規(guī)格20 cm×10 cm，單本栽插，1行區(qū)，每行11株，常規(guī)栽培管理。成熟后，按《稻種資源觀察調(diào)查項目及記載標準》調(diào)查株高、穗頸長、穗下節(jié)長、劍葉長、劍葉寬、穗長、1～2節(jié)長、實粒數(shù)、秕粒數(shù)、結(jié)實率。每小區(qū)全部調(diào)查，以其平均值作為統(tǒng)計單位進行考種。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁絡合比色法測定總黃酮含量。準確稱取糙米樣品(500 ± 1) mg于10 mL帶蓋離心管中，每管加5 mL 50%乙醇，置于振蕩器上（200次/min）振蕩 1 h。取上清液于另一離心管，5 000 r/min離心3 min，離心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.6 mL 5% 亞硝酸鈉，混勻后靜置5 min；加0.6 mL 10%的硝酸鋁，混勻后靜置6 min；加4 mL 5% 氫氧化鈉，混勻后靜置10 min，在波長500 nm處測定吸光值。從Sigma公司購買的蘆丁標準樣品濃度（2、3、4、5、6、7 mg/mL）與其吸光度之間呈良好的線性關(guān)系：y=1 512.4x-24.828，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。說明測定方法可行，準確性高、結(jié)果穩(wěn)定。

1.3.2 GABA含量測定

采用比色法測定GABA的含量。準確稱取糙米樣品（500 ± 1） mg于10 mL帶蓋離心管中，每管加5 mL蒸餾水，置于振蕩器上（200次/min）振蕩 4 h。取上清液于另一離心管，10 000 r/min離心3 min，離心之后取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加0.2 mol/L（pH9.0）硼酸鹽緩沖液0.6 mL、5%苯酚溶液2 mL、7%次氯酸鈉溶液2 mL，搖勻后放入沸水浴加熱5 min，直到顏色變成黃綠色，取出冰浴5 min，待溫度升至室溫，于645 nm處測定溶液的吸光度。從Sigma公司購買的GABA標準樣品濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL）與其吸光值具有良好的線性關(guān)系： y=44.361x-1.457，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998。說明測定方法可行，準確性高、結(jié)果穩(wěn)定。

1.3.3 RS含量測定

采用Go?i法測定RS含量。稱?。?00 ±1）mg樣品于10 mL帶蓋離心試管底部，每管內(nèi)加胰α-淀粉酶反應液4.0 mL（3 000 U/mL），放入37 ℃的水浴恒溫振蕩器中（200次/min）水解，16 h后取出。加4.0 mL 95%乙醇后在離心機上于5 000 r/min離心5 min，棄上清液，向剩下的沉淀中加4.0 mL醋酸鈉緩沖溶液（pH3.8）搖勻，加入1 000 μL 葡萄糖糖化酶液（3 000 U/mL），放入50 ℃水浴恒溫振蕩器中（200次/min），30 min后取出。3 000 r/min離心2 min，吸取上清液2.0 mL于25 mL容量瓶，加5%苯酚溶液1.0 mL，混勻后迅速滴加濃硫酸7 mL，搖勻室溫放置5 min，然后置冷水中冷卻10 min，在485 nm波長處測定吸光值。以加蒸餾水代替水解液制作空白，以0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%分析純蔗糖梯度溶液作標準直線，硫酸苯酚法顯色，標樣試驗重復進行3次，求得其回歸方程為： y=1.625 x-0.022，相關(guān)系數(shù)R2=0.994 8，具有良好的線性關(guān)系，說明測定方法可行，準確性高、結(jié)果穩(wěn)定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選擇2組平行變數(shù)水稻糙米GABA和總黃酮含量與農(nóng)藝性狀。再以農(nóng)藝性狀作為自變量（Qi），把水稻糙米GABA和總黃酮含量作為因變量（R^），采用統(tǒng)計軟件SPSS 19進行通徑和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RS、總黃酮、GABA含量及其分布

群體F6代RS、總黃酮、GABA含量為RS（6 462 mg/kg）＞ 總黃酮（697.4 mg/kg）＞ GABA（232.6 mg/kg），其中總黃酮和GABA的偏度和峰度絕對值均＜1.96，呈正態(tài)分布，而RS的偏度和峰度絕對值均＞1.96，呈偏態(tài)分布，GABA和總黃酮含量在一定范圍內(nèi)變化具有連續(xù)性，且各株系間變化幅度較大，說明水稻GABA和總黃酮含量受數(shù)量性狀控制，是一種數(shù)量性狀（圖1）。

圖1 F6代RS、GABA和總黃酮含量正態(tài)分布圖

2.2 RS、總黃酮、GABA與耐冷指標的相關(guān)性

由表1可知，F(xiàn)5和F6代中GABA含量與實粒數(shù)、秕粒數(shù)、總粒數(shù)、結(jié)實率4個耐冷指標都達到顯著或極顯著相關(guān)水平，而無論是F5還是F6代，RS含量都與實粒數(shù)、秕粒數(shù)、總粒數(shù)、結(jié)實率4個耐冷指標無明顯相關(guān)性。

表1 F5和F6代耐冷指標與RS、總黃酮、GABA的相關(guān)性

2.3 親本和RIL群體RS、總黃酮、GABA含量遺傳分析

對親本和RIL群體RS、總黃酮、GABA含量進行遺傳分析可知，GABA和總黃酮含量存在較大的遺傳變異差異。GABA含量在RIL群體平均值為678 mg/kg，明顯低于兩親本，總黃酮含量在RIL群體平均值為191 mg/kg，高于兩親本。GABA和總黃酮含量遺傳變異系數(shù)分別為20.61%和54.73%，遺傳變異范圍分別為0.415%～1.904%和0.053%～0.81%。所以RIL群體中GABA和總黃酮含量遺傳變異差異較大，在育種中選育高GABA和總黃酮含量品種時選擇空間較大，具有巨大的遺傳潛力。

表2 親本和RIL群體GABA和總黃酮含量遺傳分析

2.4 主要農(nóng)藝性狀與GABA含量遺傳通徑分析

對糙米主要農(nóng)藝性狀和GABA含量進行遺傳通徑分析，見表3。在主要農(nóng)藝性狀中只有穗長、穗下節(jié)長和實粒數(shù)的直接通徑系數(shù)為正值，與GABA含量成正相關(guān)，促進GABA含量的升高，其余直接通徑系數(shù)均為負值，與GABA含量成負相關(guān)。對糙米GABA含量影響最大的是秕粒數(shù)，結(jié)實率次之。間接通徑分析中，穗下節(jié)長和實粒數(shù)的間接通徑系數(shù)為負值，其余的各主要農(nóng)藝性狀間接通徑系數(shù)為正值。此外，直接通徑系數(shù)小于間接通徑系數(shù)的農(nóng)藝性狀有劍葉寬和結(jié)實率，說明劍葉寬和結(jié)實率對GABA含量的影響與其他農(nóng)藝性狀的間接作用有關(guān)，其中影響劍葉寬對GABA含量間接作用最大的是實粒數(shù)（0.051 4），影響結(jié)實率對GABA含量間接作用最大的是秕粒數(shù)（0.241 5）。

表3 主要農(nóng)藝性狀與GABA含量遺傳通徑分析

2.5 主要農(nóng)藝性狀與總黃酮含量遺傳通徑分析

對糙米主要農(nóng)藝性狀和總黃酮含量進行遺傳通徑分析，見表4。在主要農(nóng)藝性狀中劍葉長、株高、實粒數(shù)和穗頸長的直接通徑系數(shù)為負值，與總黃酮含量成負相關(guān)，限制總黃酮含量的升高，其余直接通徑系數(shù)均為正值，與總黃酮含量成正相關(guān)。對糙米總黃酮含量影響最大的是實粒數(shù)，秕粒數(shù)次之。間接通徑分析中，結(jié)實率、秕粒數(shù)、穗下節(jié)長和穗長的間接通徑系數(shù)為負值，其余的各主要農(nóng)藝性狀間接通徑系數(shù)為正值。此外，直接通徑系數(shù)小于間接通徑系數(shù)的農(nóng)藝性狀有劍葉長和結(jié)實率，說明劍葉長和結(jié)實率對總黃酮含量的影響與其他農(nóng)藝性狀的間接作用有關(guān)，其中影響劍葉長對總黃酮含量間接作用最大的是穗下節(jié)長（0.148 3），影響結(jié)實率對總黃酮含量間接作用最大的是秕粒數(shù)（-0.226 8）。

表4 主要農(nóng)藝性狀與糙米總黃酮含量遺傳通徑分析

2.6 主要農(nóng)藝性狀對糙米GABA含量和總黃酮含量的逐步回歸分析

把主要農(nóng)藝性狀對糙米GABA含量和總黃酮含量進行逐步回歸分析，以株高（Q1）、劍葉長（Q2）、劍葉寬（Q3）、穗頸長（Q4）、穗下節(jié)長（Q5）、1～2節(jié)長（Q6）、穗長（Q7）、實粒數(shù)（Q8）、秕粒數(shù)（Q9）和結(jié)實率（Q10）為自變量，以糙米GABA含量和總黃酮含量為因變量（R^），分別進行逐步回歸分析，建立回歸方程。建立方程時，以自變量對因變量作用大小選擇回歸方程初始參數(shù)。方程中無顯著變量可引入（F≥0.05），也無顯著的變量可剔除（F≥0.01）。得出公式如下：

以上公式中，GABA的含量和總黃酮的含量多元相關(guān)系數(shù)分別為R=0.999 95和R=0.999 97，經(jīng)檢驗均達到了極顯著水平。分析表明，GABA的含量主要受結(jié)實率（Q10）的影響，而糙米總黃酮的含量受劍葉寬（Q3）和實粒數(shù)（Q8）兩者影響，線性關(guān)系達到顯著或極顯著。

3 結(jié)論與討論

本研究對糙米RS、GABA和總黃酮含量進行了遺傳分析，其受到不同的性狀影響，同一植物的不同部位之間存在明顯差異。有學者對發(fā)芽糙米中GABA含量進行測定，發(fā)現(xiàn)發(fā)芽糙米GABA含量為普通糙米的7倍左右，可達0.428 1 mg/g。突變體RIL群里糙米GABA和總黃酮含量都存在豐富的變異，其GABA含量在0.415%～1.904%，平均值為0.678%、變異系數(shù)為20.61%；總黃酮含量在0.053%～0.81%，平均值為0.191%、變異系數(shù)為54.73%。在實際育種中選出高GABA和總黃酮含量的株系在理論上具有可行性。同時，研究還發(fā)現(xiàn)GABA和總黃酮含量在一定范圍內(nèi)變化具有連續(xù)性，且各株系間變化幅度較大，說明水稻GABA和總黃酮含量受數(shù)量性狀控制，是一種數(shù)量性狀，可為GABA和總黃酮QTL定位提供參考。

通過通徑分析發(fā)現(xiàn)，秕粒數(shù)對糙米GABA含量影響最大，結(jié)實率次之；實粒數(shù)對糙米總黃酮含量影響最大，秕粒數(shù)次之。與糙米GABA含量直接通徑系數(shù)為正值的農(nóng)藝性狀有穗長、穗下節(jié)長和實粒數(shù)，其他為負值；與糙米總黃酮含量直接通徑系數(shù)為負值的農(nóng)藝性狀有劍葉長、株高、實粒數(shù)和穗頸長，其他為正值。這表明農(nóng)藝性狀中的秕粒數(shù)、實粒數(shù)和結(jié)實率可為選育高GABA和總黃酮水稻提供參考依據(jù)。

通過逐步回歸方程分析得到了突變體RIL糙米GABA的含量主要受結(jié)實率的影響；而糙米總黃酮的含量受劍葉寬和實粒數(shù)影響，并且線性關(guān)系達到顯著或極顯著。因此，在選育生產(chǎn)中可借助回歸方程指導功能型水稻選育。