王烙佩，鄭杰，李思敏，張長城，王婷，袁丁，周志勇

（1.三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌 443002）(2.三峽大學附屬仁和醫(yī)院，湖北宜昌 443001）

心血管疾病已成為全世界第一位致死、致殘原因，年齡是心血管疾病發(fā)展的重要危險因素，統(tǒng)計顯示，50歲以上人群心血管疾病發(fā)病率顯著升高，其發(fā)病形式多樣，包括外周血管病變、冠狀動脈疾病、心力衰竭、血脂異常和高血壓等[1,2]。且大量研究結(jié)果表明，衰老心臟呈現(xiàn)獨特的組織學和生物化學特征，主要包括心肌細胞壞死增多，核增值、體積變大，結(jié)締組織聚集，心肌細胞凋亡數(shù)量增多[3]，心肌纖維化程度加重，并伴有心臟舒張功能降低和心率失常增加等風險[4]。近期研究表明，自噬活性與心肌細胞凋亡密切相關(guān)，自噬增強能有效減輕左旋硝基精氨酸誘導(dǎo)高血壓所致的心肌損傷，減輕心肌細胞凋亡[5]。且抑制自噬，加劇烏頭堿誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡[6]。

竹節(jié)參系五加科人參屬植物竹節(jié)參（Panax japonicusC. A. Mey.）的干燥根莖，其主要化學成分為竹節(jié)參總皂苷（total saponins ofPanax japonicas，TSPJ），具有補虛強壯，散瘀止血、止痛的功效，多用于素體嬴弱，跌撲損傷，咳嗽咯血以及痰多[7,8]，在我國少數(shù)民族土苗聚居地廣泛使用，在土家族稱為“草藥之王”，具有極高的藥用價值，近幾年成為研究和探索的熱點。我們課題組前期研究證實，TSPJ具有良好的心臟保護作用，能有效減輕缺血導(dǎo)致的心肌損傷，恢復(fù)心功能，并可顯著抑制急性缺血、心梗導(dǎo)致的心肌細胞凋亡[9]。近期研究顯示，TSPJ能有效改善衰老大鼠心肌形態(tài)，減輕心肌纖維化，抑制H9c2大鼠心肌細胞中促凋亡蛋白 Bax的活性，促進抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的活性、提高Bcl-2/Bax的比值，有效改善心肌細胞凋亡[10]。體外研究也發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)參總皂苷對H2O2所致心肌細胞損傷具有保護作用，可有效抑制心肌細胞凋亡[11]。但竹節(jié)參總皂苷改善衰老大鼠心肌細胞凋亡的確切機制目前尚不完全明確。本研究將利用自然衰老模型大鼠，從心肌細胞自噬方面探討竹節(jié)參總皂苷對自然衰老大鼠心肌細胞凋亡的保護作用及其可能的機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物及飼料

SPF級Sprague-Dawley雄性大鼠40只購自三峽大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（鄂）2011-0012。動物飼養(yǎng)于溫度為20～23 ℃，濕度為55%～65%，12 h明暗交替的飼養(yǎng)室。自由攝食和飲水，并定期更換消毒墊料。

1.1.2 藥物及試劑

竹節(jié)參藥材采購自恩施州椿木營，經(jīng)三峽大學生藥學專家何毓敏博士鑒定為正品竹節(jié)參。TSPJ由本研究團隊提取分離，其提取率為23%。以竹節(jié)參Ⅳa標準品為對照品，香草醛-高氯酸顯色后采用紫外分光光度法測得TSPJ的相對純度為80.3%[12]。BCA蛋白濃度定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Tunel-細胞凋亡原位檢測試劑盒(10768100)，德國Roche公司；Bax（sc-7480）購自美國Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）購自美國R&D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）購自美國Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ( # 12741)購自美國cell signaling公司；GAPDH(#5174)購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標記的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。BCA蛋白濃度定量試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Bax（sc-7480）購自美國Santa Cruze公司；Bcl-2（#625509）購自美國R & D Systems公司；Caspase-3（ab44976）、Caspase-9（ab52298）、p62（ab56416）、Beclin1（ab207612）購自美國Abcam公司；LC3Ⅰ /Ⅱ(#12741)購自美國cell signaling公司；GAPDH(#5174)購自美國Cell Signaling公司。辣根過氧化酶標記的兔抗山羊（111004）、山羊抗兔（125510）均購自武漢科瑞生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器

IX53型光學倒置顯微鏡，日本 Olympus公司；LEICA EG 1150H型石蠟包埋機、LEICA TP 1020型自動脫水機、LEICA EG 1150C型超薄切片機，德國Leica公司；Power Pac TM Basic電泳儀，美國Bio-Rad公司；Bioshine Chemi Q 4800化學發(fā)光凝膠成像自動顯影儀，上海歐翔科學儀器有限公司；JA2003電子分析天平，上海天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥

將30只18月齡SD雄性大鼠隨機分為衰老模型組、TSPJ低劑量組、TSPJ高劑量組。衰老模型組給予等量正常飼料，TSPJ低、高劑量組分別投食給予TSPJ 10 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥 6 個月至24月齡，每天1次。另取10只6月齡大鼠做青年對照組。動物處理前一晚禁食不禁水，第二天腹腔注射20%烏拉坦5 mL/kg待麻醉后，腹主動脈取血并快速取出心臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈擦干后，存儲于-80 ℃冰箱以備使用。

1.2.2 大鼠心臟組織HE染色

待大鼠麻醉后腹主動脈取血，快速取出心臟組織，經(jīng)生理鹽水沖洗后，沿垂直于縱軸中間靠心尖的位置將心臟切割成2～3 cm厚的組織塊，多聚甲醛固定24 h后，再用75%乙醇再放置24 h。經(jīng)脫水機梯度酒精脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，切片。根據(jù)HE染色步驟先經(jīng)二甲苯脫蠟，不同濃度酒精復(fù)水（由高到低），放入雙蒸水中，蘇木精染核和伊紅染色后，再梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后將組織置于通風處待殘留的甲苯揮發(fā)干凈后，滴加中性樹膠封片。待片子略干后，于倒置光學顯微鏡下仔細觀察大鼠心臟組織形態(tài)變化，并在不同視野隨機取圖。

1.2.3 Tunel試劑盒檢測大鼠心肌細胞凋亡

石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫苯入水處理后，按照Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒的操作步驟染色，光鏡觀察，正常心肌細胞核呈藍色，凋亡心肌細胞核呈棕褐色。于200倍的光鏡下每張切片隨機選擇2～3個視野，計算每個視野中凋亡細胞核數(shù)和總細胞核數(shù)，計算心肌細胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)×100%。

1.2.4 Western blot檢測大鼠心臟組織中相關(guān)蛋白的表達

-80 ℃取組織樣本，稱取心臟組織約40 mg，各組加入約500 μL裂解液，用勻漿機研磨，靜置、離心后，吸取上清液。用BCA法蛋白定量。蛋白變性后，SDS-PAGE跑膠，先80 V恒壓約30 min后，110 V恒壓電泳直至 Marker條帶完全跑開；切下所需目的條帶，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜100 min。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃過夜；洗滌一抗后，加入相應(yīng)標記的二抗，再清洗二抗，室溫孵育1 h，加入ECL顯影液顯色。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5、Image J軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±sd）表示。采用單因素方差分析法比較各組間差異的顯著性，p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹節(jié)參總皂苷對衰老大鼠心臟組織形態(tài)學的影響

光鏡可見青年對照組中大鼠心肌纖維排列整齊緊湊，結(jié)構(gòu)清晰，心肌細胞形態(tài)形態(tài)、胞質(zhì)及間質(zhì)均正常；與青年對照組相比，自然衰老模型組中大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞間隙增大，心肌細胞變性增多，間質(zhì)纖維增生，肌纖維斷裂。與 24月齡相比，TSPJ低、高劑量組大鼠心肌纖維形態(tài)得到明顯改善，纖維排列整齊，心肌細胞炎性浸潤減輕，間質(zhì)纖維增生減少。結(jié)果如圖1所示。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學改變(×200)Fig.1 Pathologic changes of myocardium tissues of rats in each group (×200)

2.2 TSPJ 對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響

圖2 竹節(jié)參總皂苷對衰老大鼠心肌細胞凋亡的影響（×200）Fig.2 The cardiomyocyte apoptosis of each group (×200)

Tunel法的原理是細胞凋亡過程中基因組DNA發(fā)生斷裂，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)可催化標記這些DNA鏈斷裂和缺口處的3'-OH末端，進行后續(xù)識別，將正常細胞核染成藍色，凋亡陽性細胞核染成棕褐色。結(jié)果顯示，與6月齡相比，24月齡大鼠細胞凋亡數(shù)顯著增加；而 TSPJ干預(yù)后心肌細胞凋亡數(shù)量明顯減少，見圖2。統(tǒng)計結(jié)果表明，與6月齡大鼠相比較，24月齡大鼠的心肌凋亡指數(shù)上升3倍；與24月齡大鼠比較，TSPJ低、高劑量組大鼠的凋亡指數(shù)分別降低49%和55%，如圖2所示。

2.3 TSPJ對衰老大鼠心臟組織 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達的影響

圖3 各組大鼠心臟組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的變化Fig.3 The protein expression of Caspase-3 and Caspase-9 in the cardiac tissues of each group

圖4 各組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bcl-2/Bax、Bax蛋白表達量的變化Fig.4 The protein expression of Bcl-2、Bcl-2/Bax and Bax in the cardiac tissues of each group

隨著年齡增長，心臟的收縮舒張功能逐漸衰退、僵硬度增加、順應(yīng)性降低，并伴隨著心肌細胞凋亡增加、氧化應(yīng)激及自噬功能障礙等，最終導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。由死亡受體和線粒體細胞色素C途徑介導(dǎo)，經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)激活 Caspase家族（cysteiny laspartate specific proteinase）最終導(dǎo)致細胞凋亡。凋亡抑制基因Bcl-2可調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，以阻止細胞色素C釋放進入胞質(zhì)，且對下游Caspase也有抑制作用，從而減少細胞凋亡。Bax與Bcl-2為同源分子，但其功能相反，是促細胞凋亡的代表[13,14]。Western Blot結(jié)果顯示，與6月齡相比，24月齡組大鼠心臟中Bax、Caspase-3和 Caspase-9的蛋白表達量分別提高了9.5倍，1.8倍和4.1倍，Bcl-2蛋白表達量及Bcl-2/Bax比值下降98%和99%，給予TSPJ干預(yù)后，與24月齡大鼠相比，TSPJ低劑量組中Bax蛋白水平下降87%，Bcl-2的表達以及 Bcl-2/Bax比值分別上升 6.5倍和19.75倍；竹節(jié)參高劑量組中Bax、Caspase-3、Caspase-9分別下調(diào)87%、65%、70%，Bcl-2的表達以及Bcl-2/Bax比值分別升高了12.75倍和138.5倍。Tunel和Western blot結(jié)果顯示，TSPJ能有效干預(yù)自然衰老過程中心肌細胞凋亡指數(shù)以及促凋亡蛋白Bax和Caspase3等蛋白的表達，提高Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比值。說明大鼠心臟組織在衰老過程中心肌細胞凋亡增多，而TSPJ能顯著改善自然衰老大鼠的心肌細胞凋亡，且呈劑量依賴性。如圖3、4所示。

2.4 TSPJ對衰老大鼠心臟組織 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62和Beclin1蛋白表達的影響

自噬誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡抵抗，當細胞自噬受阻，凋亡進程明顯加速[15]。而自噬功能障礙是心臟衰老的重要特征之一，心肌細胞終末分化的特性使得難以清除細胞內(nèi)受損的大分子和細胞器，導(dǎo)致細胞穩(wěn)態(tài)下降[16]。增強自噬活性有助于心肌細胞存活，并在對嚴重損傷（如心肌梗死、缺血和暴露于晚期糖基化終末產(chǎn)物）的反應(yīng)時，可保護心臟免受病理性重塑和功能障礙[17]。有研究表明，自噬相關(guān)基因ATG5敲除小鼠在衰老過程中會發(fā)展為擴張型心肌病，并伴有嚴重的收縮功能障礙[18]；長期服用自噬激活劑雷帕霉素可以延長小鼠的壽命[19]。本實驗結(jié)果也顯示，與6月齡大鼠青年對照組比較，24月齡自然衰老組大鼠中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1蛋白表達水平分別下降了70%和48%，p62表達顯著增加3.4倍，而TSPJ低劑量組衰老大鼠心臟組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達分別升高了5.68倍和2.6倍，p62表達減少了57%；竹節(jié)參高劑量組衰老大鼠心臟組織中 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達分別升高了5.68倍和2.6倍，p62表達減少了65%。從Western Blot結(jié)果顯示，TSPJ能有效提高自然衰老過程中心肌細胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1表達，減少p62表達。說明大鼠心臟組織在衰老過程中自噬能力下降，而 TSPJ能顯著增強自噬從而保護衰老大鼠心臟組織，如圖5所示。

圖5 各組大鼠心臟組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1蛋白表達的變化Fig.5 The protein expression of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, p62, Beclin1 inthe cardiac tissues of each group

3 結(jié)論

3.1 HE和Tunel染色結(jié)果顯示衰老大鼠心臟組織中心肌纖維排列疏松紊亂，心肌細胞變性，間質(zhì)纖維增生，心肌細胞凋亡指數(shù)上調(diào)3倍。經(jīng)TSPJ干預(yù)后，自然衰老大鼠心肌形態(tài)得到明顯改善，纖維排列整齊，心肌細胞炎性浸潤減輕，間質(zhì)纖維增生減少，低、高劑量竹節(jié)參組心肌細胞凋亡指數(shù)分別下降 49%和55%。Western Blot結(jié)果也顯示在衰老過程中，促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9表達水平分別增加9.5倍、1.8倍和4.1倍，p62表達顯著增加3.4倍，抑凋亡蛋白Bcl-2表達和Bcl-2/Bax比值分別下降98%和99%，且自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表達水平分別下降了70%和48%；與24月齡衰老大鼠相比，TSPJ能激活自噬且抑制大鼠在自然衰老過程中凋亡相關(guān)蛋白表達水平。在TSPJ低劑量組中，促凋亡蛋白Bax和P62分別下降了87%和57%，抑凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-2/Bax比值及自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1分別上調(diào)6.5倍、19.75倍、5.68倍、2.6倍；TSPJ高劑量組促凋亡蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62分別下調(diào)87%、65%、70%和65%，Bcl-2、Bcl-2 /Bax比值、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1表達分別升高了12.75倍、138.5倍、5.68倍、2.6倍。

3.2 本研究的結(jié)果證實了在衰老大鼠模型中，心肌細胞自噬活性下降，凋亡指數(shù)增高，經(jīng)竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，凋亡指數(shù)明顯下降，上調(diào) Bcl-2蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和 Beclin1表達量，下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase3、Caspase9和p62表達量。因此我們得出結(jié)論：竹節(jié)參總皂苷對自然衰老大鼠心臟具有較好的保護作用，其機制可能是通過激活自噬過程，抑制心肌細胞凋亡，本研究為進一步闡明竹節(jié)參總皂苷延緩衰老作用提供實驗室基礎(chǔ)。