宋家樂，錢波，王程強，曾榛，雷少玲，黃傲

（1.桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西高校預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西桂林 541000）（2.廣西肽王生物科技有限公司，廣西桂林 530000）（3.廣西民族大學(xué)相思湖學(xué)院，廣西南寧 530008）

腸黏膜屏障生理功能的異常是導(dǎo)致炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，腸應(yīng)激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)及腸道腫瘤發(fā)生的重要原因之一[1,2]。腸上皮細胞和細胞間緊密連接所構(gòu)成腸上皮結(jié)構(gòu)在防止病原微生物侵入，阻隔外源有害物質(zhì)進入血液循環(huán)系統(tǒng)，防止細菌移位等方面具有重大意義[3]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，IBD、IBS以及腸道腫瘤患者的腸上皮組織中細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)遭受破壞，上皮細胞通透性增大，腸黏膜屏障損毀嚴重并由此能夠引發(fā)嚴重的并發(fā)癥[4]。因此，改善腸上皮功能，維持細胞間緊密結(jié)構(gòu)完整則有助于改善IBD、IBS以及腸道腫瘤患者的臨床癥狀[5]。

辣木(Moringa oleifera)屬辣木科辣木屬多年生熱帶落葉喬木，廣泛分布于亞洲南部熱帶地區(qū)，非洲熱帶以及部分亞熱帶地區(qū)，目前已被國家認定為一類新資源食品。在我國的廣東、廣西、臺灣、云南等地均形成了具有一定規(guī)模的栽培種植[6～9]。特別是廣西壯族自治區(qū)的百色、崇左和武鳴等地在當?shù)卣闹攸c支持下已經(jīng)開展了辣木的規(guī)模化種植，并形成一定的產(chǎn)業(yè)規(guī)模[6,10]。近年來，由于活性多肽類物質(zhì)其本身所具有的抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等諸多生物活性而成為實現(xiàn)可持續(xù)性農(nóng)業(yè)和生物綜合利用研究熱點以及開發(fā)利用的重點[11]。當前，對于辣木的研究主要集中在辣木葉提取物以及辣木葉多糖等方面，而對辣木多肽的研究還不多見[7,9]。特別是，就辣木多肽提取物對于腸道功能的調(diào)控效果，尤其是對受損腸道上皮細胞高通透性保護作用的研究鮮見報道。人結(jié)腸癌 Caco-2細胞是一株具有與正常小腸上皮細胞類似的緊密連接、微絨毛等結(jié)構(gòu)而被公認用于腸道屏障損傷與修復(fù)機制研究的經(jīng)典細胞系[12]。因此，本研究在基于LPS處理所制備的Caco-2腸上皮細胞高通透性模型中探討辣木多肽對細胞高通透性的保護效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)，美國 Thermo Scientific公司；Trizol試劑、OligodT18、RNase、dNTPs、MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Invitrogen公司；ROX reference Dye和SYBR Premix Ex Taq II，大連寶生物工程公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40，分子量40000 Da)、大腸桿菌脂多糖(LPS)，美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-8、TNF-α試劑盒，美國Cloud colon公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。辣木多肽(MOPP)由廣西肽王生物科技股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Biotek Elx808酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；ND2000超微量核酸蛋白測定儀、3110型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；AL204電子分析天平，梅特勒-托利多公司上海有限公司；電熱恒溫水浴鍋 HWS-28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀，德國BMG公司；MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜細胞電阻儀，美國Millipore公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與分組

Caco-2人結(jié)腸腺癌細胞(源自中國科學(xué)院上海細胞資源中心)系由桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院鄒先瓊教授饋贈，本研究室保種傳代。DMEM高糖型細胞培養(yǎng)液(含10% FBS與1%青-鏈霉素雙抗液)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下濕化培養(yǎng)。細胞貼壁長至80%時，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化傳代后用于實驗。DMEM培養(yǎng)液(含LPS：2 μg/mL)處理細胞24 h制備細胞模型。模型細胞以辣木多肽(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h并進行后續(xù)實驗。正常組為未經(jīng)過任何處理的正常Caco-2細胞。

1.4 細胞存活率及LDH脫氫酶水平測定

細胞按前述分組處理后，移除內(nèi)培養(yǎng)基(用于后續(xù)LDH酶活性測定)并加入100 μL的MTT試劑(終質(zhì)量濃度：0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入DMSO (100 μL)避光振蕩30 min，測定OD490nm后按公式：細胞生存率(%)＝OD樣品組/OD正常組×100來計算細胞生存率。LDH脫氫酶水平采用比色試劑盒按照說明書操作要求進行測定。

1.5 IL-1β、IL-8、TNF-α 分泌水平的測定

細胞接種到培養(yǎng)板并依前述方法處理后，4 ℃下收集細胞培養(yǎng)上清液。取適量培養(yǎng)上清液按照IL-1β、IL-8、TNF-α測定試劑盒說明書步驟操作(單位以pg/mL表示)。

1.6 模型細胞的膜通透性水平測定

依前述處理后的細胞接種至Transwell小室中，實驗前測定跨上皮細胞電阻(trans epithelialelectrical resistance，TEER)檢查細胞融合狀態(tài)和腸上皮屏障的完整性，取細胞屏障完整的細胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于實驗。移除Transwell小室內(nèi)外的培養(yǎng)液，HBSS液(pH 7.4)沖洗細胞3次，37 ℃孵育30 min后測量TEER值，待TEER值穩(wěn)定后記錄數(shù)據(jù)。此外，在Transwell小室頂端腔內(nèi)加入100 μL的HBSS液(含有終濃度為1 mg/mL的FD-40)，37 ℃孵育2 h，收集側(cè)腔內(nèi)溶液，使用FLUOstar OPTIMA熒光酶標儀測定熒光強度(激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長530 nm)。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.7 細胞中 IL-1β、IL-8、TNF-α、occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的mRNA表達

Trizol試劑盒法提取細胞內(nèi)總RNA，紫外分光檢測提純后的RNA濃度用于后續(xù)實驗。取總RNA(2 μg)加入 dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(1 μL)、RNases抑制劑(1 μL)及 5×Buffer (10 μL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取適量cDNA(2 μL)用qRT-PCR法檢測 IL-1β、IL-8、TNF-α、Occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的表達量。在總反應(yīng)體系中(20 μL)加入上游和下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II (10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和滅菌雙蒸水(5.6 μL)，充分混勻后置于Quant Studio TM 6 Flex PCR儀中進行反應(yīng)。擴增反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s，95 ℃25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，共 35～40 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。每個基因cDNA樣本平行擴增3次，取Ct值均數(shù)，依公式計算目的基因表達量[F=2(檢測樣品中基因的Cr值-檢測樣品中持家基因的Cr值)/2(空白樣品中基因的Cr值-空白樣品中持家基因的Cr值)]。相關(guān)基因的引物序列見表1所示。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

本研究中，所有實驗均重復(fù) 3次，結(jié)果以均值(means)±標準偏差(SD)表示。所得實驗數(shù)據(jù)運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析與統(tǒng)計處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 辣木多肽對細胞生存率和LDH釋放水平的影響

Caco-2細胞經(jīng)2 μg/mL的LPS處理后，細胞生存率下降至41.3%(表2)。給予辣木多肽處理后，受損細胞的生存率逐漸升高并呈顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。特別是在經(jīng)加高濃度(100 μg/mL 和 150 μg/mL)辣木多肽處理后，細胞生存率分別升高至72.9%和83.8%，生存率分別較未處理的模型細胞增高1.77倍和2.03倍。正常處于細胞內(nèi)部的LDH在細胞遭受外界強烈應(yīng)激刺激導(dǎo)致細胞膜損傷后能夠直接從細胞內(nèi)部溢出，因此被常用作評估細胞損傷程度的一種生物指標[13]。與正常組細胞相比，LPS模型組細胞中LDH的溢出量為正常細胞的6.45倍。經(jīng)辣木多肽處理模型細胞后，細胞 LDH外溢水平顯著降低，且抑制效果存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。較高濃度的辣木多肽(100 μg/mL和150 μg/mL)處理后，細胞中LDH溢出水平分別較未經(jīng)處理的模型細胞LDH溢出水平降低40.9%和50.3%。

2.2 辣木多肽對 IL-1β、IL-8、TNF-α 分泌水平的影響

IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性細胞因子的異常表達是導(dǎo)致腸組織細胞間緊密連接丟失以及細胞上皮屏障損傷的主要原因，也在IBD發(fā)病過程中起著重要的作用[11～15]。如圖 1所示，LPS處理能顯著刺激Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌。而辣木多肽處理能夠顯著抑制模型細胞中 IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌。特別是，高濃度辣木多肽(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠使細胞中的IL-1β水平分別較模型細胞中IL-1β水平降低10.6%和19.8%，IL-8水平降低36.4%和43.7%，TNF-α水平降低30.7%和37.9%。

圖1 辣木多肽對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α分泌水平的影響Fig.1 Effects of MOPP on IL-1β, IL-8 and TNF-α levels in LPStreated intestinal Caco-2 cells

2.3 辣木多肽對 IL-1β、IL-8與 TNF-α 的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

LPS(2 μg/mL)刺激能顯著誘發(fā) Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄(圖2)。不同濃度的辣木多肽處理能夠抑制IL-1β、IL-8和TNF-α的異常轉(zhuǎn)錄。與模型組細胞相比，高濃度的辣木多肽(100 μg/mL和150 μg/mL)能夠分別降低模型細胞中IL-1β轉(zhuǎn)錄水平至32.8%和44.3%，IL-8轉(zhuǎn)錄水平至32.6%和35.0%，TNF-α轉(zhuǎn)錄水平至25.7%和33.5%。抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等的過度表達能夠直接改善腸組織炎癥水平，從而緩解高炎癥環(huán)境所致腸上皮細胞緊密連接丟失的發(fā)生[1,12,13]。

圖2 辣木多肽對LPS處理Caco-2細胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響Fig.2 Effects of MOPP on IL-1β, IL-8 and TNF-α mRNA expression in intestinal Caco-2 cells

2.4 辣木多肽對LPS處理Caco-2細胞的膜通透性影響

細胞的跨上皮細胞電阻(TEER)值和異硫氰酸熒光素(FITC)-右旋糖酐(FD40)是用于檢測腸上皮細胞單層屏障功能變化的經(jīng)典生物指標[16]。TEER值主要反映腸上皮屏障模型的離子通透性改變情況[17]。如表3所示，LPS處理顯著造成Caco-2細胞TEER值的降低。給予不同濃度辣木多肽能夠顯著回升模型細胞的TEER 值(p＜0.05)。其中，辣木多肽(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 和 150 μg/mL)處理組細胞分別較LPS組細胞的TEER值升高1.22倍、1.57倍、1.80倍和2.04倍。此外，F(xiàn)ITC-右旋糖酐(FD-40)通過率也是反映腸上皮屏障功能是否正常的指標之一，F(xiàn)D-40透過水平越高則細胞的通透性損傷發(fā)生程度越高[18]。LPS刺激顯著造成Caco-2細胞的通透性增高(p＜0.05)。辣木多肽處理能夠顯著模型細胞的 FD-40透過水平(p＜0.05)。辣木多肽(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和150 μg/mL)處理組細胞分別較模型組細胞的FD-40透過水平降低4.9%、15.7%、25.1%和33.3%。

表3 辣木多肽對LPS處理Caco-2細胞TEER與FD-40透過度的影響Table 3 Effects of MOPP on TEER and FD-40 levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

圖3 辣木多肽對LPS處理Caco-2細胞中細胞間緊密連接相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.3 Effects of MOPP on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.5 辣木多肽對 Occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響

Occludin、claudin-1與ZO-1蛋白是構(gòu)成細胞間緊密連接(tight junction，TJs)的重要結(jié)構(gòu)蛋白[19]。TJ結(jié)構(gòu)在參與調(diào)控物質(zhì)的跨腸上皮運輸，維持細胞間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及負責(zé)細胞間的通訊等方面具有非常重要的意義[20]。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LPS刺激Caco-2細胞后，細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(圖 3)。與正常組相比，模型細胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別下降67.2%，49.6%和48.4%。相反，給予辣木多肽處理后，模型細胞中 Occludin、claudin-1和 ZO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著回升。高濃度辣木多肽(100 μg/mL和 150 μg/mL)能夠較模型細胞分別提升Occludin(2.30倍與2.61倍)、claudin-1(1.55倍與1.85倍)和ZO-1(1.52倍與1.68倍)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

如圖3所示，LPS刺激能顯著造成Caco-2細胞中MLCK 的轉(zhuǎn)錄水平升高(p＜0.05)。而辣木多肽能夠抑制模型細胞中MLCK的轉(zhuǎn)錄水平。與模型組相比，高濃度(100 μg/mL和150 μg/mL)的辣木多肽可顯著抑制MLCK的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(抑制率分別為 28.0%和31.3%)。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)能夠通過促肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化使其參與肌動蛋白收縮，引發(fā)細胞骨架重排，破壞細胞TJ結(jié)構(gòu)，最終造成細胞間通透性增高[21]。抑制腸上皮細胞中MLCK的過度活化，對于維持腸上皮細胞屏障和細胞間緊密連接的重要作用[22]。

3 結(jié)論

本研究基于LPS構(gòu)建的Caco-2腸上皮細胞高通透性細胞模型研究了辣木多肽提取物對細胞高通透性的改善效果。研究發(fā)現(xiàn)，辣木多肽能夠有效抑制LPS刺激所造成的細胞損傷后LDH外溢，并抑制LPS所造成的細胞死亡。辣木多肽可有效抑制LPS刺激所致IL-1β、IL-8和 TNF-α炎性細胞因子分泌并抑制其mRNA轉(zhuǎn)錄。此外，辣木多肽處理還能改善模型細胞的高通透性發(fā)生。從分子層面上，辣木多肽能顯著上調(diào)受損細胞中TJ相關(guān)因子(Occludin、claudin-1和ZO-1)的mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制導(dǎo)致細胞TJ丟失的MLCK的mRNA高轉(zhuǎn)錄。綜合上述研究結(jié)果，辣木多肽對LPS所致 Caco-2細胞發(fā)生高通透性的保護作用可能與其具有較強的抗炎作用以及對細胞 TJ相關(guān)因子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控能力有關(guān)。在后續(xù)研究中，課題組將重點針對辣木多肽是否具有 MLCK活化過程中的上、下游信號通路的調(diào)控作用而展開深入研究。