謝芳，楊銀洲，張斌,2，王志剛，黃強,2

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.中新國際聯(lián)合研究院，廣東廣州 511363）（3.廣州市浪奇實業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510660）

球晶為一種具有一定徑向對稱性的半結晶體，具有雙折射現(xiàn)象，其在偏振光下呈“馬耳他十字”狀[1]。淀粉球晶由淀粉降解后通過重結晶而制備的[1～3]，目前制備淀粉球晶的常用方法為酸解法與酶解法。酸解法主要分為兩步：一是快速的酸解淀粉無定型區(qū)，由于無定形區(qū)的結構疏松，在氫離子的作用下，脫水葡萄糖的構象發(fā)生改變，由椅式轉變成船式，進而破壞淀粉糖苷鍵；二是緩慢酸解淀粉結晶區(qū)，該區(qū)域結構緊實，氫離子不易滲透，因而結晶區(qū)的酸解過程需依靠溶劑作用，作用于外部糖苷鍵的同時，由表及內(nèi)逐層水解[4,5]。目前主要利用HCl和H2SO4水解淀粉來制備短直鏈淀粉球晶[6]。酸解法用時較長，回收率較低。劉延奇等[7]利用鹽酸水解玉米淀粉35 d，所制A-型淀粉球晶回收率僅為28.2%。酶解法是用脫支酶水解淀粉，異淀粉酶和普魯蘭酶是最常用的兩種脫支酶[8]，作用位點為α-1,6鍵，異淀粉酶能專一水解支鏈淀粉中的α-1,6鍵，酶解產(chǎn)生α-構型的短直鏈淀粉[9]。酶解法制備淀粉球晶的理化性質(zhì)由淀粉的分子大小和濃度、加酶量、冷卻速率和結晶時間等多種因素決定。Cai等[10]以蠟質(zhì)玉米淀粉和蠟質(zhì)馬鈴薯淀粉為原料，利用異淀粉酶在不同的溶液濃度，結晶時間和鏈長分布條件下制備出A型和B型的淀粉球晶，證實可以通過控制酶解及重結晶條件設計生產(chǎn)不同結晶類型和消化特性的淀粉球晶。

淀粉球晶具有一些獨特的功能和特點，可作為穩(wěn)定劑、增稠劑和保型劑等廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領域[11,12]。在維持食品品質(zhì)的同時可防止食品中油脂的氧化[12]；與原淀粉相比，淀粉球晶中含有較多的慢消化或抗消化淀粉，Kiatponglarp等[13]證實由蠟質(zhì)米淀粉和普通米淀粉制備的淀粉球晶都具有抗酶解的能力，且蠟質(zhì)米淀粉所得球晶的抗酶解效果更佳，這種抗消化的特性有利于餐后血糖的控制與腸道健康。

本文探究了蠟質(zhì)玉米淀粉制備淀粉球晶的工藝條件，采用酶法制備淀粉球晶，考察不同加酶量和結晶時間對淀粉球晶的顆粒形貌、結晶度及熱力學性質(zhì)的影響，為淀粉球晶的制備與應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗材料：蠟質(zhì)玉米淀粉，食品級，購于德州大成食品有限公司。

試驗試劑：異淀粉酶（1000 U/mL）：愛爾蘭Megazyme公司；醋酸鈉、冰醋酸：（分析純），國藥集團化學試劑有限公司，

1.2 儀器與設備

pH 計（SevenEasy），梅特勒-托利多有限公司；集熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S），鞏義市予華儀器有限責任公司；耐壓瓶（100 mL），上海精密科學儀器有限公司；核磁共振儀（HD 600），德國Bruker公司；體積排阻色譜（Agilent1200），島津分析檢測儀器有限公司；高速離心機（5180R），艾本德生物技術有限公司；冷凍干燥機（SCIENTZ-18N），寧波新芝凍干設備股份有限公司；激光粒度儀（MS2000），英國Malvern儀器有限公司；掃描電子顯微鏡（EVO 18），德國Carl Zeiss公司；X射線衍射儀（D8 ADVANCE），德國Bruker公司；差式掃描量熱儀（DSC8000），美國PE公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 淀粉球晶的制備

將淀粉與 0.01 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH=4.0±0.1）混合配制成質(zhì)量分數(shù)為15%的淀粉乳[10,14]，均分為5份，分別放置于耐壓瓶中，密封沸水浴加熱1 h，后于120 ℃中油浴30 min使其充分糊化，冷卻至50 ℃，分別加入5 U/g、10 U/g、15 U/g、20 U/g和25 U/g異淀粉酶進行酶解，反應24 h后，于140 ℃下加熱20 min滅酶，后冷卻至25 ℃，保持緩慢攪拌（轉速20 r/min）分別在結晶0.5 h、2 h、4 h、8 h、16 h和24 h時取樣，5000 r/min離心、水洗，重復三次，冷凍干燥，得淀粉球晶。

1.3.2 鏈長分布的測定

鏈長分布通過熒光毛細管輔助糖電泳法（FACE）檢測獲得，其測定方法參照Wu等[15]。

1.3.3 淀粉球晶分支程度的測定

稱取5 mg淀粉樣品于核磁管中，加入0.5 mL氘代二甲基亞砜，在 80 ℃水浴鍋中充分溶解。核磁檢測條件：檢測溫度為70 ℃，核磁頻率為600.17 MHz，探針為PABBO（脈沖880 μS 90°，掃描次數(shù)128次，重復時間15.98 s。分支度的計算方法如式1-1所示。

其中：Iα-1,4和Iα-1,6分別代表淀粉分子中α-1,4鍵（大約5.11×10-6）和α-1,6鍵（大約4.75×10-6）在核磁共振圖譜中所代表峰的積分面積。

1.3.4 回收率

將不同結晶時間下獲得淀粉球晶稱重，所得淀粉球晶的干基質(zhì)量M2與所用蠟質(zhì)玉米原淀粉干基質(zhì)量M1之比[16]，如式1-2所示。

1.3.5 淀粉球晶的掃描電鏡觀察（SEM）

淀粉球晶樣品于105 ℃下干燥3 h，用導電雙面膠將處理好的樣品固定在樣品臺上，置于離子濺射儀中噴金，在掃描電鏡下觀察淀粉球晶樣品，選擇具有代表性的樣品，分別放大1000倍和5000倍進行拍攝[17]。

1.3.6 淀粉球晶的結晶結構測定（XRD）

測定之前將淀粉樣品置于濕度為 100%的干燥器中，平衡24 h；測定條件：Cu-Ka射線，40 kV電壓，40 mA電流，起始角和終止角分別為4°和35°，掃描步長0.04°，速度38.4 s/步。樣品的相對結晶度由MdI Jade 6.5軟件測出。

1.3.7 淀粉球晶的熱力學性質(zhì)分析（DSC）

測定方法參考Cai等[16]。將濃度為30%淀粉樣品密封于 DSC盤中，平衡過夜，以空盤作為參照，從30 ℃加熱至150 ℃，加熱速率為10 ℃/min，通過Pyris軟件分析淀粉球晶的起糊溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Tc）和焓值（△H），并記錄結果。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

各組實驗數(shù)據(jù)重復3次測定，采用Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行檢驗。

2 結果與討論

2.1 蠟質(zhì)玉米淀粉和淀粉球晶鏈長分布及其分支度

為了探究蠟質(zhì)玉米淀粉及其淀粉球晶的側鏈鏈長分布，通過熒光毛細管輔助糖電泳法（FACE）對其分析表征。表1是蠟質(zhì)玉米淀粉及其所制淀粉球晶的鏈長分布表，由表 1可知，蠟質(zhì)玉米淀粉側鏈長 6～13和14～24的比例較淀粉球晶的高，而在鏈長25～36及大于37的比例較淀粉球晶的低；蠟質(zhì)玉米淀粉的平均鏈長小于淀粉球晶鏈長，原因是長鏈的直鏈淀粉容易結晶沉淀析出，而分子量較小、鏈長較短的直鏈淀粉（小于10）不能形成雙螺旋結構參與到晶體的形成，在制備過程中被洗滌棄去[18]，淀粉球晶的鏈長分布峰值后移，這表明形成淀粉球晶的直鏈淀粉鏈長基本在10以上。Cai等[16]研究表明，脫支蠟質(zhì)小麥淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉和蠟質(zhì)馬鈴薯淀粉的平均鏈長分別為21.8，24.1和32.1，而重結晶得到的短直鏈直鏈淀粉的平均粒徑分比為28.1，29.2和35.5，且相較于未處理的淀粉，重結晶后的樣品也出現(xiàn)鏈長分布峰后移的現(xiàn)象，與本文的結果一致。

表1 蠟質(zhì)玉米淀粉（WM）和淀粉球晶（SCAS）的鏈長分布Table 1 The distribution of waxy maize starch (WM) and the short chain amylose spherulites (SCAS)

圖1 淀粉球晶的核磁共振氫譜圖Fig.1 1H NMR spectra of starch spherulites

根據(jù)核磁共振氫譜中α-1,6 鍵（4.7×10-6～5.0×10-6）和α-1,4 鍵（5.1×10-6～5.4×10-6）化學位移處的峰面積大小來計算[19]，當位于 4.7×10-6～5.0×10-6的α-1,6 鍵峰面積積分為0時，表明蠟質(zhì)淀粉已完全脫支。圖1為蠟質(zhì)玉米淀粉和淀粉球晶的核磁共振氫譜圖。蠟質(zhì)玉米淀粉的分支度為 5.8%，隨著加酶量的增加（5～25 U/g），α-1,6鍵的峰面積減小，直至峰面積為0；淀粉的分支度從加酶量5 U/g的2.07%降為25 U/g的0%，表明在加酶量為25 U/g時，蠟質(zhì)玉米淀粉基本上被完全脫支。許晶晶等[20]證實1%的支鏈淀粉溶液中加入5 μL異淀粉酶（173 U/g）作用2 h后可完全水解，通過核磁共振氫譜圖譜顯示，異淀粉酶可在一定條件下將玉米支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵水解，對α-1,4糖苷鍵無水解作用，完全水解支鏈淀粉可生成具有α或β型還原末端的直鏈淀粉鏈或麥芽寡糖，且產(chǎn)物的聚合度（DP）主要在15～35之間。

2.2 結晶時間對淀粉球晶性質(zhì)的影響

2.2.1 回收率

圖2 回收率與結晶時間的關系Fig.2 Relationship between the yield of starch spherulites and crystallization time

圖2為結晶時間對回收率的影響，由圖2可以看出，隨著結晶時間的延長，回收率由結晶時間為0.5 h的56.85%提高至24 h的76.58%，且回收率在結晶16 h后趨于穩(wěn)定。這是因為淀粉球晶的形成需要一個過程，直鏈淀粉先形成雙螺旋結構，再成核，后堆積長大，在結晶時間較短時（0.5～4 h），一部分直鏈淀粉還未參與到淀粉球晶的形成，在洗滌的過程中被棄去；而隨著結晶時間的繼續(xù)增加（8 h后），絕大部分直鏈淀粉已經(jīng)結晶沉淀，只有一小部分聚合度小于10的短鏈，不能形成雙螺旋結構，也無法參與到直鏈淀粉球晶的形成，在結晶過程中損失。與酸解法相比，本研究的回收率遠高于酸法制備淀粉納米晶回收率（15.7%，W/W）[21]。此外，Cai等[10]報道酶解法脫支的蠟質(zhì)淀粉在25 ℃結晶下淀粉球晶的回收率為72%。

2.2.2 淀粉球晶的形貌

圖3 不同結晶時間下的淀粉球晶掃描電鏡圖Fig.3 SEM of starch spherulites at different crystallization time

不同結晶時間淀粉球晶的掃描電鏡圖如3所示。從圖3可以看出，結晶時間為0.5 h所形成的淀粉球晶輪廓邊界不清晰，容易堆積成體積較大的顆粒，當結晶時間大于8 h，淀粉球晶的輪廓清晰，單個顆粒的粒徑在800 nm左右，但容易聚集在一起形成較大的顆粒。造成此現(xiàn)象的可能原因為：一是淀粉球晶粒較小，顆粒表面的范德華力和靜電引力較大，易團聚；二是直鏈淀粉在堆積的過程中，有交叉現(xiàn)象。Kiatponglarp等[13]通過酶解蠟質(zhì)米淀粉和米淀粉，然后重結晶制得的淀粉球晶平均粒徑大小分別為 7.9±2.1 μm and 14.6±3.7 μm，SEM顯示，球晶會聚集形成球粒。Rajesh等[22]采用直鏈淀粉-棕櫚酸復合物制備淀粉球晶，由光學顯微鏡、熱臺顯微鏡、SEM和透射電鏡等手段觀察，發(fā)現(xiàn)所制的球晶有球狀、“雪球狀”和環(huán)面/圓盤狀，球晶之間也出現(xiàn)粘連的現(xiàn)象。Cai等[10]制備的淀粉球晶出現(xiàn)聚集，且球粒表面未顯示出淀粉球晶清晰的輪廓。

2.2.3 淀粉球晶的結晶結構

短鏈直鏈淀粉通過三個步驟形成球晶：（1）淀粉鏈結合成雙螺旋并形成簇；（2）結晶單元重排成納米顆粒；（3）顆粒生長成為聚集體[16,23]。

圖4 蠟質(zhì)玉米淀粉和淀粉球晶X射線衍射圖Fig.4 The X-ray diffraction patterns of waxy maize starch and starch spherulites

圖4為淀粉球晶的X射線衍射圖，從圖4可以看出，蠟質(zhì)玉米淀粉為A型結晶淀粉，而淀粉球晶為B型結晶，淀粉球晶的晶體類型和結晶溫度有很大的關系，有文獻報道當結晶溫度為4 ℃或25 ℃時，短直鏈淀粉晶體為B型，50 ℃時為A型晶體[16]，本研究結果與文獻報道一致，隨著結晶時間的增加，其結晶度由原淀粉的 37.0%增加至結晶 24 h的 51.1%，與Wang等[23]的研究結論相一致。這表明隨著結晶時間的增加，其結晶度有增加趨勢，在結晶16 h后趨于平緩。白霞[24]研究發(fā)現(xiàn)淀粉球晶在室溫下初始結晶度隨著時間的延長而增大，而在結晶1 d后結晶度不再變化。結晶度的增加，間接反映出組成淀粉球晶的直鏈淀粉排列有序性的提高，形成的球晶結構緊密。

2.2.4 淀粉球晶的熱力學性質(zhì)

不同結晶時間下淀粉球晶熱力學性質(zhì)如表 2所示。由表2可以看出，淀粉球晶的起糊溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Tc）和焓值（△H）顯著高于原淀粉，與Cai等[16]的研究結果一致；淀粉球晶的起糊溫度隨結晶時間的增加而升高，結晶24 h后淀粉球晶的起糊溫度、峰值溫度、終止溫度和焓值分別達到75.09 ℃、90.96 ℃、107.03 ℃和17.44 ℃。表明形成的淀粉球晶相對于蠟質(zhì)玉米淀粉結構較為緊密，在較高溫度下才能破壞晶體結構；吸熱焓值和淀粉結晶度有一定的對應關系[25]，焓值越高，結晶度也相應增加，這和XRD測得結果相吻合，也和Liu等[26]報道的結果一致。

表2 蠟質(zhì)玉米淀粉和淀粉球晶的熱力學性質(zhì)Table 2 Thermodynamic properties of waxy maize starch and starch spherulites

3 結論

本研究以蠟質(zhì)玉米淀粉為原料制備淀粉球晶，糊化后加入25 U/g異淀粉酶淀粉可完全脫支；在25 ℃下結晶，隨著結晶時間的延長，回收率與結晶度可隨著結晶時間的延長而增加，于24 h達到最高，分別為76.58%與51.1%；熱力學性質(zhì)中起糊溫度（To）、峰值溫度（Tp）、終止溫度（Tc）和焓值（△H）則隨之的增加而增加；SEM圖像表明雖然隨著結晶時間的增加淀粉球晶的顆粒形態(tài)逐漸清晰，而淀粉顆粒之間存在聚集現(xiàn)象。在最佳用酶量為25 U/g與結晶時間為24 h條件下可高效制備淀粉球晶，為淀粉球晶的工業(yè)化生產(chǎn)和應用提供了理論基礎。為了利用球晶的顆粒性質(zhì)，后續(xù)要解決酶法制備淀粉球晶團聚現(xiàn)象，從而拓展淀粉球晶應用的領域。