江連洲，尋崇榮，綦玉曼，吳長玲，普拉謝克夫?亞歷山大?尤里耶維奇，范志軍，許振國，李 楊，王中江，謝鳳英,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.克麥羅沃國立大學(xué)，俄羅斯 克麥羅沃州 620034；3.黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150036；4.山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司，山東 聊城 252800）

豆乳粉中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)及大豆低聚糖、大豆異黃酮、大豆卵磷脂等功能性成分，易于人體消化吸收，深受消費(fèi)者的喜愛。目前，傳統(tǒng)濕法工藝制備豆乳粉應(yīng)用較廣[1]，但傳統(tǒng)工藝技術(shù)制得的豆乳粉具有致敏性，致敏蛋白主要是大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、Gly m Bd 30 kDa（P34）和GIy m Bd 28 kDa[2]。目前，酶解是降低大豆致敏性最有效的方法，但酶解的主要缺點(diǎn)是不完全破壞抗原表位且形成強(qiáng)烈的苦味，不利于豆乳粉在國內(nèi)外的市場推廣[3]。

近年來，有利用超高壓處理技術(shù)降低大豆蛋白致敏性，研究表明，相對(duì)于其他物理方法，超高壓處理對(duì)大豆蛋白致敏性降低率最大[4]。超高壓主要是改變蛋白的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，主要以氫鍵、疏水相互作用維持，改變與過敏相關(guān)的抗原表位，降低致敏性[3,5]。Pe?as等[6]研究表明豆?jié){經(jīng)Corolase PN-L和堿性蛋白酶水解后，不呈現(xiàn)抗原性，但預(yù)實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)這兩種酶得到的無致敏性豆乳粉有苦味肽產(chǎn)生，降低豆乳粉的口感。因此本研究以超高壓協(xié)同酶解降低豆乳粉致敏性，改善豆乳粉口感。

李慧靜[4]研究表明超高靜壓可改變蛋白的結(jié)構(gòu)，使大豆分離蛋白柔性結(jié)構(gòu)增加，暴露更多酶切位點(diǎn)，與中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶酶解降低大豆分離蛋白致敏性有協(xié)同作用，且無苦味產(chǎn)生。鄭環(huán)宇[7]及Meinlschmidt[3]等利用超高壓協(xié)助風(fēng)味蛋白酶酶解大豆分離蛋白，探討對(duì)致敏性的影響，結(jié)果表明超高壓與風(fēng)味蛋白酶酶解具有協(xié)同作用。謝丹丹等[8]利用超高壓協(xié)同木瓜蛋白酶酶解處理南美白對(duì)蝦水溶性蛋白，結(jié)果表明高壓可降低蛋白的致敏性，與連續(xù)超高壓直接酶解相比，高壓預(yù)處理后進(jìn)行酶解有較高的致敏性降低率。白小娟[9]利用超高壓協(xié)同酶解處理大豆分離蛋白，通過對(duì)大豆蛋白致敏原P34的降解率進(jìn)行分析，結(jié)果表明風(fēng)味蛋白酶效果最好，在最優(yōu)工藝條件下（大豆分離蛋白添加量5%、pH 7.5、酶解溫度50 ℃、時(shí)間120 min、加酶量1 000 U/g）大豆蛋白致敏原P34的致敏性完全消除。且在最佳超高壓條件下，風(fēng)味蛋白酶酶解效率提高50%。

目前，已有研究報(bào)道采用超高壓協(xié)同限制性酶解降低大豆蛋白致敏性，然而將該技術(shù)應(yīng)用到豆乳粉加工中的研究尚鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)濕法加工技術(shù)制備豆乳粉為基礎(chǔ)，利用超高壓協(xié)同限制性酶解以降低豆乳粉致敏性，通過響應(yīng)面法對(duì)超高壓-限制性酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以得到低致敏性豆乳粉；對(duì)豆乳粉的蛋白質(zhì)分散指數(shù)、蛋白質(zhì)體外消化率、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖譜及感官評(píng)價(jià)進(jìn)行分析，為低致敏性豆乳粉的生產(chǎn)加工提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 哈爾濱九三油脂集團(tuán)；大豆磷脂 周口慧洋飼料有限公司；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶（500 LAPU/g） 黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司；大豆過敏原檢測試劑盒 上海日邦食品有限公司青島分公司；凝膠制備試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)液上海升正公司；考馬斯亮藍(lán)（R-250）、胃蛋白酶（782 U/mg）、凝乳酶（40 U/mg）、胰蛋白酶（500 U/mg） 華美生物工程有限公司；實(shí)驗(yàn)所需基礎(chǔ)試劑（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FDM-Z80豆?jié){機(jī) 上海偉業(yè)儀器廠；Ultra-Turrax T25高速分散器 德國IKA公司；噴霧干燥機(jī) 無錫昂益達(dá)機(jī)械有限公司；AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SH-1000酶標(biāo)儀 日本Corona Electric公司；垂直板電泳儀 北京六一儀器公司；凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司；XW-80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；UHPF-750 MPa-3L超高靜壓設(shè)備包頭科發(fā)公司；高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；THZ-80水浴鍋 江蘇電子有限公司；HYP-II八孔消化爐 上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動(dòng)蒸餾器 江蘇省宜興市科教儀器研究所。

1.3 方法

1.3.1 豆乳粉的制備工藝

黃豆→篩選→浸泡→熱燙→磨漿→漿渣過濾分離→超高壓處理→限制性酶（復(fù)合風(fēng)味蛋白酶）解→滅酶→大豆磷脂調(diào)配→濃縮→高壓均質(zhì)→噴霧干燥→豆乳粉

參照齊寶坤等[10]的方法，稱量50 g黃豆，浸泡10 h（0.5% NaHCO3溶液），熱燙5 min（沸水），弱堿水磨漿（豆水質(zhì)量比1∶7，pH 6.5～7.0，溫度90 ℃），過濾除去漿渣，對(duì)豆乳進(jìn)行超高壓處理，對(duì)超高壓處理后的豆乳溫度和pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，限制性酶酶解，95 ℃滅酶5 min，混入2%的乳化劑大豆磷脂，真空濃縮（濃縮至固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%左右即可），均質(zhì)處理后，噴霧干燥（進(jìn)口溫度185 ℃、出口溫度85 ℃）即得豆乳粉樣品。設(shè)置3 組對(duì)照：對(duì)照組1：不進(jìn)行超高壓及酶解處理，其他條件與上述一致；對(duì)照組2：只進(jìn)行酶解處理（酶解時(shí)間64 min、酶添加量0.3 U/g），不進(jìn)行超高壓處理，其他條件與上述一致；對(duì)照組3：只進(jìn)行超高壓處理（超高壓處理溫度50 ℃、超高壓處理壓強(qiáng)320.00 MPa、超高壓處理時(shí)間16 min），不進(jìn)行酶解處理，其他條件與上述一致。

1.3.2 超高壓工藝單因素試驗(yàn)

保持酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間60 min、酶解pH 7.5、酶添加量（以豆乳粉質(zhì)量計(jì)）0.3 U/g。在其他條件不變的情況下，分別選取超高壓處理壓強(qiáng)為100、200、300、400、500 MPa，處理時(shí)間為5、10、15、20、25 min，處理溫度為10、20、30、40、50、60 ℃進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過過敏原含量分析確定超高壓處理工藝單因素最優(yōu)條件。

1.3.3 限制性酶解工藝單因素試驗(yàn)

保持超高壓處理壓強(qiáng)300 MPa、處理時(shí)間15 min、處理溫度50 ℃，在其他條件不變的情況下，分別選取酶解時(shí)間20、40、60、80、100 min，酶添加量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U/g進(jìn)行單因素試驗(yàn)。通過過敏原含量比較分析確定酶解工藝單因素最優(yōu)條件。

1.3.4 超高壓-限制性酶解工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

以致敏性降低率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)考察超高壓處理壓強(qiáng)、超高壓處理時(shí)間、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值、酶添加量對(duì)該指標(biāo)的影響規(guī)律。進(jìn)一步利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，選取超高壓處理壓強(qiáng)、超高壓處理時(shí)間、酶解時(shí)間、酶添加量4 個(gè)因素為自變量，以致敏性降低率為響應(yīng)值，設(shè)置4因素3水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in response surface methodology

1.3.5 過敏原含量的測定

1.3.5.1 豆乳粉過敏原的提取

對(duì)不同工藝下制備的豆乳粉進(jìn)行石油醚脫脂處理，記錄脫脂豆乳粉占原豆乳粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；參照李慧靜[4]的方法，稱取3 g脫脂豆乳粉于離心管中，加入57 mL過敏原提取液（0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液），混合均勻，于搖床中室溫振蕩12 h，3 000×g室溫離心20 min，取上清液，用0.45 μm膜過濾，用稀釋緩沖液稀釋20 倍，得到樣品測試液。

1.3.5.2 夾心式酶聯(lián)免疫法測定大豆過敏原含量

參照李慧靜[4]的方法，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定樣品的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法確定上清液樣品中過敏原含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.045 2X+0.042 8，R2=0.985，其中，Y為大豆過敏原含量/（mg/g），X為樣品測試液于450 nm波長處的吸光度。對(duì)照組即1.3.1節(jié)中不進(jìn)行超高壓及酶解處理的豆乳粉，根據(jù)1.3.5節(jié)的步驟測定過敏原含量。致敏性降低率按式（1）計(jì)算：

1.3.6 溶解性的測定

溶解性用蛋白質(zhì)分散指數(shù)表示。參照齊寶坤等[10]的方法，取5 g不同工藝制備的豆乳粉樣品，溶于100 mL去離子水中，攪拌30 min使豆乳粉充分溶解，靜置分層后進(jìn)行離心（3 000 r/min、10 min），利用凱氏定氮法測定離心后上清液蛋白含量。按式（2）計(jì)算蛋白質(zhì)分散指數(shù)（溶解性）：

1.3.7 體外模擬胃腸道消化實(shí)驗(yàn)

參考夏明敬[11]的方法，對(duì)豆乳粉中蛋白的消化利用率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，稱取2 g不同工藝制備的豆乳粉，溶于100 mL去離子水中，在37 ℃的浴鍋中預(yù)熱10 min。用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，加入50 U/g的胃蛋白酶和75 U/g的凝乳酶不斷攪拌水解1 h后，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0。然后加入1 000 U/g的胰蛋白酶，不斷攪拌2 h，到時(shí)間后經(jīng)沸水浴滅活5 min。取10 mL消化液于燒杯中，加入10 mL的10%三氯乙酸溶液促進(jìn)蛋白沉淀，然后進(jìn)行離心處理（4 000 r/min，10 min）[4]。利用凱氏定氮法測定上清液中可溶性蛋白含量。按式（3）計(jì)算蛋白質(zhì)消化率：

1.3.8 SDS-PAGE分析

將不同工藝制備的豆乳粉進(jìn)行石油醚脫脂處理。參考Laemmli等[12]的方法，15%分離膠，5%濃縮膠，將9 mg/mL豆乳粉蛋白樣品與上樣緩沖液（100 mg SDS，0.25 mL β-巰基乙醇，2 mg溴酚藍(lán)，2 mL pH 8.0 0.05 mol/L Tris-HCl溶液，甘油2.0 mL，定容至10 mL，配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL），分別取30、10 μL混合均勻，于95 ℃加熱5 min，上樣量10 μL。電泳過程恒壓，濃縮膠80 V，分離膠120 V。固定液：甲醇-冰乙酸-水體積比為5∶1∶5；染色液：取0.125 g考馬斯亮藍(lán)R-250溶于250 mL固定液中；脫色液：甲醇-冰乙酸-水體積比為3∶2∶35。

1.3.9 豆乳粉苦味的感官評(píng)價(jià)

參考馮學(xué)武[13]的方法，對(duì)豆乳粉苦味進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，由10 人組成評(píng)定小組，蒸餾水漱口后，取評(píng)定液（豆乳粉與蒸餾水以質(zhì)量比1∶2攪拌混合）3 mL于口中保持10 s，漱口后品嘗標(biāo)準(zhǔn)液（參照Charalambous等[14]方法制備標(biāo)準(zhǔn)液，以奎寧為基準(zhǔn)物設(shè)置苦味上下限，以a（3×10－6mol/L）為下限，以8a為上限，其中a為無苦味、2a為微苦味、4a為中苦味、8a為苦味），如確認(rèn)兩味道相近，即可將待評(píng)定液的苦味值定為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值，否則需取其他標(biāo)準(zhǔn)液再嘗，直至確定苦味值。結(jié)果取10 人評(píng)定的平均值[15-16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 18對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）分析；采用Origin 8.5軟件進(jìn)行作圖；數(shù)據(jù)及方差分析利用響應(yīng)面分析的Design-Expert軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超高壓處理壓強(qiáng)對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響

圖1 超高壓處理壓強(qiáng)對(duì)豆乳粉致敏性的影響Fig. 1 Effect of UHP pressure on allergenicity of soybean milk powder

由圖1可知，當(dāng)超高壓處理壓強(qiáng)從0 MPa升高到300 MPa時(shí)，豆乳粉中過敏原含量隨壓強(qiáng)的增加而顯著減少（P＜0.05），繼續(xù)增加壓強(qiáng)，豆乳粉中過敏原含量變化不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，超高壓處理對(duì)限制性酶解降低豆乳粉致敏性有協(xié)同作用，在處理壓強(qiáng)為300 MPa時(shí)，豆乳粉過敏原含量最少，降低致敏性效果最好。該結(jié)果與李慧靜[4]、Meinlschmidt等[3]的研究結(jié)果一致，即超高壓處理可降低大豆致敏性，且與限制性酶解有協(xié)同作用。原因是超高壓處理改變了貯藏蛋白的球狀結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)展開，柔性增加，暴露更多酶切位點(diǎn)，促進(jìn)酶解進(jìn)行，提高蛋白水解度，降低豆乳粉致敏性[17-18]。Puppo等[19]研究發(fā)現(xiàn)，超高壓處理壓強(qiáng)高于200 MPa時(shí)，可通過非共價(jià)鍵斷裂改變7S、11S球蛋白結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)展開[20-21]，Meinlschmidt等[3]的研究表明，超高壓處理壓強(qiáng)高于200 MPa時(shí)，水解度顯著提高，進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)論。綜合考慮，選擇最佳超高壓處理壓強(qiáng)為300 MPa。

2.1.2 超高壓處理時(shí)間對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響

圖2 超高壓處理時(shí)間對(duì)豆乳粉致敏性的影響Fig. 2 Effect of UHP treatment time on allergenicity of soybean milk powder

由圖2可知，當(dāng)超高壓時(shí)間由0 min延長到15 min時(shí)，豆乳粉中過敏原含量隨著超高壓時(shí)間的延長而顯著性減少（P＜0.05），而超過15 min后繼續(xù)延長超高壓時(shí)間，過敏原含量有增加趨勢，但變化不顯著（P＞0.05）。原因可能是隨著超高壓處理時(shí)間的延長，豆乳中蛋白不斷變性，結(jié)構(gòu)逐漸展開，促進(jìn)酶解的進(jìn)行，降低致敏性；但隨著處理時(shí)間的繼續(xù)延長，蛋白重新聚集，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致過敏原含量增加[4,9]。白小娟[9]的研究表明，超高壓處理時(shí)間長于5 min時(shí)，大分子蛋白降解，20 kDa的小分子肽增多，說明需要保壓一定時(shí)間，蛋白結(jié)構(gòu)才會(huì)展開，促進(jìn)酶解的進(jìn)行。由李慧靜[4]的研究結(jié)果可知，蛋白的表面疏水性隨時(shí)間的延長而增加，超高壓處理時(shí)間為15 min時(shí)，表面疏水性最大，繼續(xù)延長時(shí)間，表面疏水性下降，表明處理時(shí)間過長，導(dǎo)致蛋白重新聚集，疏水基團(tuán)重新包裹于蛋白內(nèi)部，導(dǎo)致蛋白疏水性下降，進(jìn)一步證明上述推論。另外處理時(shí)間不同，過敏原表位暴露程度不同，導(dǎo)致過敏原含量發(fā)生變化[22]。綜合考慮超高壓能耗成本，選擇最佳超高壓處理時(shí)間為15 min。

2.1.3 超高壓處理溫度對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響

圖3 超高壓處理溫度對(duì)豆乳粉致敏性的影響Fig. 3 Effect of UHP treatment temperature on allergenicity of soybean milk powder

由圖3可知，過敏原含量隨超高壓處理溫度的不同有顯著變化（P＜0.05），處理溫度由10 ℃升高到30 ℃時(shí)，過敏原含量隨溫度的升高逐漸增加；繼續(xù)升高溫度至50 ℃時(shí)，過敏原含量隨溫度的升高而減少，50 ℃時(shí)過敏原含量最低；繼續(xù)升高溫度，過敏原含量增加。原因可能是溫度不同，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)展開程度、柔性蛋白含量及抗原表位暴露程度的不同，對(duì)下一酶解工藝的酶促反應(yīng)階段產(chǎn)生不同的影響；溫度變化也可能改變蛋白在乳液油水界面的吸附形式，抗原表位包裹于蛋白分子內(nèi)部，或者破壞蛋白質(zhì)的抗原表位，影響豆乳粉中的過敏原含量[23]。Long Fangyu等[24]研究表明高壓與熱處理有協(xié)同效應(yīng)，在壓力600 MPa、55～75 ℃條件下處理10 min，花生的免疫細(xì)胞幾乎完全喪失，進(jìn)一步證明溫度對(duì)蛋白致敏性影響的復(fù)雜性。綜合考慮，選擇最佳超高壓處理溫度為50 ℃。

2.2 限制性酶解工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)豆乳粉致敏性的影響Fig. 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on allergenicity of soybean milk powder

由圖4可知，當(dāng)酶解時(shí)間從0 min延長到60 min時(shí)，豆乳粉中過敏原含量顯著減少（P＜0.05），酶解時(shí)間為60 min時(shí)，豆乳粉中過敏原含量僅為1.21 mg/g，繼續(xù)延長酶解時(shí)間，過敏原含量變化不顯著（P＞0.05）。與未酶解的豆乳粉（酶解時(shí)間0 min）相比，豆乳粉中過敏原含量顯著下降，說明經(jīng)超高壓處理后酶解可顯著降低豆乳粉致敏性，進(jìn)一步說明限制性酶解與超高壓對(duì)降低豆乳粉致敏性的協(xié)同作用。原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白水解度不斷增加，大分子致敏性蛋白逐漸降解為小分子肽，蛋白致敏性降低；而繼續(xù)延長酶解時(shí)間對(duì)過敏原含量影響不明顯，可能是因?yàn)樾》肿与臍埓娴闹旅粜圆荒鼙幻附庀齕9,25]。由白小娟[9]的研究可知，利用風(fēng)味蛋白酶水解大豆蛋白，在水解30 min后，7S及11S致敏蛋白被酶解為小分子肽，而酶解時(shí)間延長到60 min后，仍含有部分P34致敏蛋白，進(jìn)一步證明上述推論。綜合考慮，選擇最佳酶解時(shí)間為60 min。

2.2.2 酶添加量對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響

圖5 酶添加量對(duì)降低豆乳粉致敏性的影響Fig. 5 Effect of enzyme concentration on allergenicity of soybean milk powder

由圖5可知，酶解后豆乳粉過敏原含量顯著減少（P＜0.05），與只超高壓處理的豆乳粉相比，過敏原含量減少了42.48%。隨著酶添加量的增加，豆乳粉中過敏原含量逐漸減少，酶添加量為0.3 U/g時(shí)，繼續(xù)增加酶添加量，過敏原含量變化不大（P＞0.05）。進(jìn)一步說明限制性酶解與超高壓在降低致敏性方面的協(xié)同作用，這與Meinlschmidt等[3]及白小娟[9]的研究結(jié)果一致。原因可能是豆乳中酶相對(duì)含量增加，促進(jìn)酶解反應(yīng)進(jìn)行，豆乳中蛋白的水解度提高，大分子致敏蛋白降解為致敏性較低的小分子肽，降低豆乳粉致敏性[3-5]。由于酶制劑成本較高，綜合考慮，選擇最佳酶添加量為0.3 U/g。

2.3 超高壓-限制性酶解降低豆乳粉致敏性的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert進(jìn)行響應(yīng)面法過程優(yōu)化，以超高壓處理壓強(qiáng)、超高壓處理時(shí)間、酶解時(shí)間、酶添加量4 個(gè)因素為自變量，以致敏性降低率為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental scheme and results for response surface analysis

豆乳粉的致敏性降低率通過Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次回歸模型方程為：

R=84.60+10.00A+8.25B+10.33C+13.92D+6.00AB－6.00AC+0.50AD+6.00BC+0.75BD－5.50CD－11.01A2－15.88B2－11.51C2－12.88D2

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression model

由表2、3可知，擬合方程線性關(guān)系顯著，模型回歸項(xiàng)顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型擬合度R2為96.57%，為93.13%，表明該模型可有效模擬試驗(yàn)數(shù)據(jù)，故可利用該模型對(duì)響應(yīng)最優(yōu)值進(jìn)行理論推測。通過F檢驗(yàn)比較得知各因子貢獻(xiàn)率依次為：D＞C＞A＞B，即酶添加量＞酶解時(shí)間＞超高壓處理壓強(qiáng)＞超高壓處理時(shí)間?；陧憫?yīng)面尋優(yōu)分析確定的最優(yōu)工藝參數(shù)為超高壓處理壓強(qiáng)320.00 MPa、超高壓處理時(shí)間16 min、酶解時(shí)間64 min、酶添加量0.3 U/g，致敏性降低率最優(yōu)值為88.35%。

圖6 兩因素交互作用對(duì)豆乳粉致敏性降低率影響的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on percent reduction in soybean milk powder allergenicity

為適應(yīng)生產(chǎn)，將制備條件優(yōu)化為超高壓處理壓強(qiáng)320.00 MPa、超高壓處理時(shí)間15 min、酶解時(shí)間60 min、酶添加量0.3 U/g，此條件下豆乳粉的致敏性降低率為88.09%，說明響應(yīng)值的實(shí)驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好。由感官評(píng)價(jià)的結(jié)果可知，此條件下得到的豆乳粉有微苦味，以豆乳粉-木糖醇質(zhì)量比為1∶3調(diào)配后，豆乳粉沒有苦味，為低致敏性豆乳粉的加工推廣提供實(shí)驗(yàn)參考。

2.4 不同工藝豆乳粉溶解性、蛋白質(zhì)消化率及過敏原含量的對(duì)比分析

圖7 不同豆乳粉的溶解性、蛋白消化利用率及過敏原含量Fig. 7 Protein dispersibility indexes, protein digestibility and allergen contents of different soybean milk powders

由圖7可知，與傳統(tǒng)濕法工藝相比，經(jīng)超高壓、酶解、超高壓-限制性酶解工藝制備的豆乳粉，其溶解性及蛋白質(zhì)消化率均顯著增加（P＜0.05），過敏原含量顯著減少（P＜0.05），且與單獨(dú)超高壓處理制備的豆乳粉相比，單獨(dú)酶解制備的豆乳粉蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少，但蛋白質(zhì)分散指數(shù)變化不顯著（P＞0.05）。超高壓-限制性酶解制備工藝得到的蛋白質(zhì)分散指數(shù)及蛋白質(zhì)消化率最高，可分別高達(dá)84.2%及81.65%，過敏原含量最少，為1.20 mg/g，且與單獨(dú)超高壓和酶解處理相比，超高壓-限制性酶解制備的豆乳粉，其蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少，進(jìn)一步證明超高壓與限制性酶解的協(xié)同作用，可一定程度上改善豆乳粉的營養(yǎng)性及安全性。原因可能是超高壓處理導(dǎo)致大豆蛋白結(jié)構(gòu)變化，柔性增加，提高蛋白的界面吸附能力，乳化性增強(qiáng)，對(duì)豆乳中的油脂有更高的包裹效率，繼而提高豆乳粉的溶解性及蛋白質(zhì)消化率；酶解處理導(dǎo)致蛋白大分子降解為小分子多肽，疏水基團(tuán)、極性基團(tuán)暴露，蛋白的表面電荷分布加強(qiáng)，乳化能力提高，從而豆乳粉溶解性增大，酶解物小分子肽更易被人體消化吸收，繼而提高豆乳粉的蛋白質(zhì)消化率[26-28]。

2.5 不同工藝豆乳粉分子質(zhì)量分布的對(duì)比分析

圖8 不同豆乳粉乳液的SDS-PAGE圖Fig. 8 Protein electrophoresis patterns of different soybean milk emulsions

由圖8可知，傳統(tǒng)濕法工藝制備的豆乳粉主要致敏蛋白為β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白，Gly m Bd 30 kDa（P34）和GIy m Bd 28 kDa含量較少。經(jīng)超高壓制備的豆乳粉與傳統(tǒng)濕法工藝相比，SDS-PAGE圖譜變化不大，說明超高壓處理降低致敏性的原理主要是改變豆乳蛋白的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗原表位埋藏于蛋白內(nèi)部，或者在乳化過程中，蛋白在水包油界面發(fā)生復(fù)雜性變化，可能與大豆磷脂結(jié)合，使抗原表位失活。經(jīng)限制性酶解工藝制備的豆乳粉β-伴大豆球蛋白已完全降解，但還有少量的大豆球蛋白G2堿性鏈，說明風(fēng)味蛋白酶對(duì)β-伴大豆球蛋白的降解效果更好，分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽增多，說明限制性酶解降低豆乳粉致敏性的作用機(jī)理主要是對(duì)致敏蛋白的降解作用，進(jìn)一步證明限制性酶解對(duì)降低豆乳粉致敏性的積極影響[3]；經(jīng)超高壓-限制性酶解工藝得到的豆乳粉，β-伴大豆球蛋白已完全降解，與單獨(dú)酶解制備的豆乳粉電泳條帶相比，大豆球蛋白G2堿性鏈及分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽所對(duì)應(yīng)條帶顏色較淺，小分子肽進(jìn)一步降解為游離氨基酸，進(jìn)一步說明超高壓與限制性酶解對(duì)降低致敏性的協(xié)同效應(yīng)[29-30]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)超高壓-限制性酶解制備低致敏性豆乳粉工藝進(jìn)行研究，單因素試驗(yàn)表明超高壓處理壓強(qiáng)、超高壓處理時(shí)間、超高壓處理溫度、酶解時(shí)間及酶添加量對(duì)豆乳粉中抗敏原含量均有顯著影響。由響應(yīng)面分析結(jié)果可知，超高壓-限制性酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為超高壓處理壓強(qiáng)320.00 MPa、超高壓處理時(shí)間15 min、酶解時(shí)間60 min、酶添加量0.3 U/g，此條件下致敏性降低率為88.09%，但制備的豆乳粉具有微苦味，需進(jìn)行豆乳粉-木糖醇質(zhì)量比為1∶3的調(diào)配后遮蔽苦味。且分別采用離心法、體外模擬胃腸道消化及夾心式酶聯(lián)免疫法對(duì)比不同工藝制備豆乳粉的溶解性、蛋白質(zhì)消化率及過敏原含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)濕法工藝相比，經(jīng)超高壓、酶解、超高壓-限制性酶解工藝制備的豆乳粉，其溶解性及蛋白質(zhì)消化率均顯著增加（P＜0.05），過敏原含量顯著減少（P＜0.05），且超高壓與限制性酶解具有協(xié)同作用，與單獨(dú)超高壓和酶解處理相比，該工藝制備豆乳粉的蛋白質(zhì)消化率顯著提高，過敏原含量顯著減少。由SDS-PAGE分析可知傳統(tǒng)濕法工藝制備豆乳粉主要致敏蛋白為β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白；經(jīng)超高壓制備的豆乳粉與傳統(tǒng)濕法工藝相比，SDS-PAGE圖譜變化不大；限制性酶解處理可完全降解豆乳粉的β-伴大豆球蛋白，保留少量大豆球蛋白G2堿性鏈；經(jīng)超高壓-限制性酶解工藝得到的豆乳粉，β-伴大豆球蛋白已完全降解，部分大豆球蛋白G2堿性鏈及分子質(zhì)量低于11 kDa的小分子肽進(jìn)一步降解為游離氨基酸，進(jìn)一步說明超高壓與限制性酶解對(duì)降低致敏性的協(xié)同效應(yīng)。