田 玲，周 諾

(1.浙江省立同德醫(yī)院口腔科，杭州 310000； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科， 南寧 530021)

內(nèi)皮祖細(xì)胞自1997年被Asahara教授[1]發(fā)現(xiàn)以來，與內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)的研究接踵而至，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞可在多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞主要來源于骨髓，外周血及臍帶，其中骨髓中含量最高，且骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力是外周血的50倍[2]，但Epcs從骨髓中獲取較難，培養(yǎng)基昂貴，如何促進(jìn)其擴(kuò)增及增強(qiáng)其生物學(xué)特性一直是一大難題。近年來，研究者們在研究中發(fā)現(xiàn)了多種促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和動(dòng)員等相關(guān)生物學(xué)特性有關(guān)的信號(hào)因子及信號(hào)通路，祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的多種中藥亦發(fā)現(xiàn)對內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能有良好的促進(jìn)效果，很多疾病通過改善內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能特性達(dá)到了良好的治療效果，現(xiàn)將相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的細(xì)胞因子

影響內(nèi)皮祖細(xì)胞功能特性的細(xì)胞因子較多，這些細(xì)胞因子一方面給內(nèi)皮祖細(xì)胞提供營養(yǎng)，一方面調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移、動(dòng)員能力，近年來人們研究較多的有以下幾種：

1.1 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)

血管內(nèi)皮生長因子家族由以下成員組成：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F、PLGF。最近，該家族又加入了內(nèi)分泌腺衍生的血管內(nèi)皮生長因子(EG-VEGF)。VEGF的受體稱為VEGFR，主要有以下幾種：VEGFR-1、VEGFR-2(又稱KDR)、VEGFR-3(又稱Flt-4)。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，VEGFR-3主要在淋巴內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種重要的促血管生成活性的生長因子，對內(nèi)皮細(xì)胞具有促進(jìn)分裂和抗凋亡作用，還可增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移，它在調(diào)節(jié)正常和病理性血管生成過程中起積極作用，對內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長也存在重要作用。張文斌等[3]用含不同濃度的VEGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)用較低濃度的VEGF培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞時(shí)，內(nèi)皮祖細(xì)胞的粘附能力、遷移能力、增殖能力等都得到了增強(qiáng)，但VEGF濃度較高時(shí)增強(qiáng)效果反而不明顯[4]；崔斌等[5]用含VEGF的培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)Epcs的數(shù)量及分泌eNOS的功能。王偉等[6]轉(zhuǎn)染了VEGF基因到Epcs后，發(fā)現(xiàn)Epcs分泌VEGF的能力和內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力均得到了提高。

1.2 缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)

HIF-1是一種調(diào)節(jié)新生血管形成的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α是HIF-1的α亞單位，是調(diào)控HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的缺氧傳感器。缺氧時(shí)，脯氨酰羥化酶(PHDs)的活性受到抑制，進(jìn)而抑制HIF-1α的泛素化，導(dǎo)致HIF-1的激活[7]。HIF-1還能促進(jìn)新生血管化和神經(jīng)發(fā)生，有利于神經(jīng)從缺血性損傷中恢復(fù)。但是，在腦缺血的急性階段，過度激活的HIF-1會(huì)損害血腦屏障。Liu等[8]用慢病毒沉默了小鼠HIF-1α基因，發(fā)現(xiàn)其降低了內(nèi)源性和外源性骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢功能，并發(fā)現(xiàn)其可能導(dǎo)致了VEGF-A、VEGF-A/FLK-1、NRP1和DLL4表達(dá)的降低，推測HIF-1α可能通過CXCL12/CXCR4和Hmg1參與EPCs歸巢，并通過VEGF-A/flk1-nrp1/dll4信號(hào)通路促進(jìn)骨髓來源的EPCs形成新生血管。姜萌等[9]用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HIF基因到Epcs中，使Epcs過表達(dá)HIF，檢測后發(fā)現(xiàn)HIF基因轉(zhuǎn)染成功后Epcs表達(dá)FLK、VEGF、eNOS等下游蛋白均增多。

1.3 基質(zhì)生長因子(stromal cell-derived factor- 1, SDF-1)

SDF-1是由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，是一種重要的調(diào)節(jié)干細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)出骨髓微環(huán)境的細(xì)胞因子，血清中SDF-1的濃度與循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量關(guān)系較密切。有學(xué)者比較發(fā)生了高風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管和低風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管的兩組患者外周血中SDF-1含量和Epcs數(shù)量及遷移情況，發(fā)現(xiàn)發(fā)生了高風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管組的患者血清中SDF-1濃度低于低風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管組，而EPCs的增殖和遷移率也低于低風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管組，對于短暫性腦缺血發(fā)作和輕微腦卒中患者，可用循環(huán)EPCs和血清SDF-1濃度來預(yù)測高風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管發(fā)生，他們認(rèn)為循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和遷移的減少可能與高風(fēng)險(xiǎn)非損傷性腦血管發(fā)生有關(guān)，表明血清中SDF-1的濃度與循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量存在一定關(guān)系[10]。

1.4 去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)

有研究證明NE可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移能力，姜其鈞等[11]給左下肢缺血的實(shí)驗(yàn)組小鼠持續(xù)性注入去甲腎上腺素，對照組給予生理鹽水注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血、骨髓、脾臟的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量較對照組均上升，并證明NE是通過Akt-eNOS信號(hào)通路調(diào)節(jié)了此過程。

還有很多細(xì)胞因子也可影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，如Chen等[12]發(fā)現(xiàn)BMP-2可促進(jìn)Epcs的遷移和成管，有研究發(fā)現(xiàn)整合素α6的上調(diào)與 Epcs的血管生成功能有關(guān)[13]。

2 信號(hào)通路

目前許多正在進(jìn)行的工作集中在通過操縱信號(hào)通路來改變細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)，如操控Wnt/β-catenin和骨形態(tài)發(fā)生蛋白通路，減少了干細(xì)胞的異質(zhì)性，促進(jìn)了干細(xì)胞移植治療的可行性[14]；激活SDF-1/CXCR4信號(hào)通路調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員到受損傷區(qū)域等。當(dāng)前研究較多的通路有以下幾條：

2.1 基質(zhì)衍生因子/趨化因子受體-4 (SDF-1/CXCR4) 信號(hào)通路

SDF-1，即基質(zhì)衍生因子-1，又稱 CXCL12，屬于CXC趨化因子家族。它的N段是受體結(jié)合所必需的，特征是7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與G蛋白結(jié)合，是結(jié)合及激活趨化因子受體的區(qū)域。SDF-1的受體是CXCR4，CXCR4是由352個(gè)氨基酸分子組成的蛋白質(zhì)，當(dāng)CXCR4被激活時(shí)，它會(huì)將多種信號(hào)轉(zhuǎn)換成對細(xì)胞的趨化，分化，凋亡等生物功能的控制。CXCR4表達(dá)在多種細(xì)胞上，包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞等血細(xì)胞，造血干細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞，在內(nèi)皮細(xì)胞上也有表達(dá)，已有研究證明其激活無論在體內(nèi)或體外均能促進(jìn)血管形成[15]。

SDF-1/CXCR4軸在胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，主要功能之一是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中祖細(xì)胞的運(yùn)輸，調(diào)控細(xì)胞趨化和歸巢到機(jī)體受損傷的部位[16]。SDF-1/CXCR4對Epcs的影響一方面在于SDF-1吸引了Epcs從骨髓動(dòng)員到外周血，另一方面在于目前公認(rèn)內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)CD34，Askari等人[5]研究發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞表達(dá)CXCR4，而SDF-1可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞遷移和血管生成。

近年來，此信號(hào)通路介導(dǎo)的祖細(xì)胞動(dòng)員還被廣泛應(yīng)用于臨床研究中，如運(yùn)用于器官移植、球囊血管成形術(shù)或支架植入術(shù)后觀察到的血管損傷誘導(dǎo)的再狹窄模型中進(jìn)行研究[17-18]。

2.2 磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶 (PI3K/AKT)信號(hào)通路

PI3K是由一個(gè)110×103大小的催化亞基(p110)和一個(gè)85×103大小的調(diào)節(jié)亞基(p85)組成的二聚體。PI3K下游可影響細(xì)胞凋亡，細(xì)胞分化，細(xì)胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等。P110亞基在細(xì)胞膜內(nèi)表面產(chǎn)生pip3，pip3可吸收pdk1，然后pdk1磷酸物激活A(yù)KT，進(jìn)而激活下游通路。AKT，即絲氨酸/蘇氨酸激酶，稱作蛋白激酶B或PKB，是一種原癌基因，AKT激酶家族包含三種亞型，AKT1、AKT2、AKT3，與細(xì)胞生存生長有著密切關(guān)系。其中AKT1是最多的，由pdk1和pdk2磷酸化。AKT2在對胰島素起反應(yīng)的組織中表達(dá)，如肌肉組織，它對葡萄糖代謝起著重要作用。Akt3在腦和睪丸中表達(dá)較多。PI3K/AKT的下游可調(diào)節(jié)eNOS的表達(dá)。NO主要由eNOS合成， eNos通路能促進(jìn)eNos的表達(dá)，從而使NO的分泌增多，刁玉剛等[19]將eNOS基因轉(zhuǎn)入大鼠的Epcs后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中NO含量明顯增高。

Cao等[20]對糖尿病小鼠和健康小鼠的Epcs分別進(jìn)行培養(yǎng)，MTT法結(jié)果表明糖尿病患者Epcs的活力低于健康小鼠，用西紅花酸治療后，糖尿病組Epcs的增殖能力得到了改善，且遷移能力得到了提高，研究人員發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，西紅花酸增加了pAKT和p-eNOS的表達(dá)，從而激活了PI3K/AKT/eNOS信號(hào)通路，恢復(fù)受損傷Epcs產(chǎn)生eNOS的能力。Li等[21]使Epcs的LncRNA WTAPP1基因分別過表達(dá)和沉默，發(fā)現(xiàn)LncRNA WTAPP1可通過PI3K/AKT調(diào)節(jié)MMP-1的表達(dá)，積極調(diào)節(jié)Epcs的遷移、侵襲功能和體內(nèi)外成管能力。

馬穎等[22]用差速貼壁法培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，檢測PI3K、AKT、AC133、vWF等的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AC133, PI3K、AKT的表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸減弱，vWF的表達(dá)沒有變化，提示PI3K/AKT信號(hào)通路參與了內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的過程，可能促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。

2.3 Wnt信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路是由Wnt蛋白與胞膜上的受體結(jié)合激活，根據(jù)其是否有β-catenin分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt通路。劉凱等[23]用機(jī)械力及成血管誘導(dǎo)液共同刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)β-catenin及下游的VEGFA蛋白表達(dá)均顯著增強(qiáng)，同時(shí)PCR結(jié)果顯示與Wnt信號(hào)通路相關(guān)的一系列相關(guān)蛋白的基因表達(dá)亦增強(qiáng)。崔斌等[24]用氯化鋰抑制Wnt信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控蛋白GSK-3的表達(dá)，以激活Wnt信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)Wnt通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白β-catenin及下游Cyclin D1表達(dá)均增加，內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖也明顯增加；余濤[25]在體外構(gòu)建沉默Wnt3a基因的重組質(zhì)粒，用脂質(zhì)體作為介導(dǎo)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)沉默了Wnt3a的小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖受到了明顯抑制。Wnt非經(jīng)典通路亦被研究發(fā)現(xiàn)可調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，楊棟等[26]在培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入外源性的Wnt5a，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和成管能力均增加。

還有很多信號(hào)通路也被報(bào)道與Epcs有關(guān)，如李小林等[27]發(fā)現(xiàn)NOTCH信號(hào)通路可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖分化，尹華曦等[28]發(fā)現(xiàn)雌激素可通過MAPK通路促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和遷移能力，戰(zhàn)麗麗等[29]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥可通過激活MMP-9信號(hào)通路促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓動(dòng)員到血液循環(huán)。

3 中藥對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響：

近年來很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥可作為內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，研究較多的主要有以下幾種：

3.1 黃芪多糖

吳青等[30]用含黃芪多糖的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)800 mg/L的黃芪多糖能顯著促進(jìn)Epcs的增殖，且此現(xiàn)象能被PI3K阻斷劑LY294002阻斷，Western blot結(jié)果提示黃芪多糖能促進(jìn)Epcs的Akt、eNOS磷酸化，表明黃芪多糖可能是通過此通路促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能。

3.2 補(bǔ)腎活血中藥

戴國華等[31]每日用補(bǔ)腎活血中藥給心肌缺血的小鼠灌胃，對照組僅給予生理鹽水，一個(gè)月后取兩組小鼠的外周及骨髓的Epcs進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)給藥組Epcs的數(shù)量較對照組明顯增多，同時(shí)VEGF、SDF-1α的表達(dá)亦增多，此中藥可有效促進(jìn)Epcs的增殖及相關(guān)功能。

3.3 丹酚酸

封亞麗等[32]從健康人的外周血中分離出Epcs并進(jìn)行培養(yǎng)，7 d后換成含丹酚酸的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、分化和旁分化能力進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)丹酚酸處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖能力及培養(yǎng)基上清液中VEGF、SDF-1 及 IL-8 水平均增加。劉璐菘等[33]做了類似的實(shí)驗(yàn)，也得出來了相似的結(jié)果，表明丹酚酸可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖功能及自分化、旁分化功能。

3.4 姜黃素

駱明炎等[34]用不同濃度的姜黃素處理內(nèi)皮祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)低濃度姜黃素對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移、粘附等功能有促進(jìn)作用，高濃度則相反，并發(fā)現(xiàn)適宜濃度的姜黃素可能抑制骨鈣素的表達(dá)，從而改善心血管患者的血管功能。

3.5 鹿茸

賀怡然等[35]發(fā)現(xiàn)鹿茸可促進(jìn)骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)內(nèi)皮的功能，他們給予下肢缺血的小鼠分高、中、低三個(gè)劑量進(jìn)行灌胃給藥，然后抽取小鼠的腹主動(dòng)脈血進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高劑量的鹿茸能顯著促進(jìn)Epcs的增殖和VEGF、NO的表達(dá)，從而促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)，改善機(jī)體的缺血狀況。

3.6 柚皮苷

趙志虎等[36]用不同濃度的柚皮苷培養(yǎng)來自骨髓的Epcs，發(fā)現(xiàn)500 μg/mL的柚皮苷能顯著促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及SDF-1α，CXCR-4等基因及蛋白的表達(dá)，而加入柚皮苷組與加入CXCR-4抑制劑及PI3K抑制劑組比，成血管能力上升，表明柚皮苷促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖及生物學(xué)特性可能與SDF-1α/CXCR-4/PI3K/AKT功能軸有關(guān)。

目前，中藥促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)特性的影響機(jī)制還不甚了解，未來還需做更多的研究，方能更恰當(dāng)?shù)膶⒅兴庍\(yùn)用到內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)節(jié)中來。

4 內(nèi)皮祖細(xì)胞在臨床疾病治療的研究進(jìn)展

近年來學(xué)者們發(fā)現(xiàn)有很多疾病可通過改變內(nèi)皮祖細(xì)胞生物性能來進(jìn)行治療或改善癥狀，如光療促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)性能:有研究者發(fā)現(xiàn)光療能顯著促進(jìn)Epcs動(dòng)員到循環(huán)中，他們運(yùn)用光療治療患有呼吸窘迫綜合征的患兒，發(fā)現(xiàn)光療可增加循環(huán)中Epcs的數(shù)量，促進(jìn)Epcs增殖，成管，趨化等，改善肺的功能，從而改善了其呼吸功能，未來有望通過此方法改善患有呼吸窘迫綜合征患兒的呼吸情況從而達(dá)到預(yù)防支氣管肺發(fā)育不良[37]。還有研究者同樣用光療治療患有嚴(yán)重高膽紅素血癥的嬰兒，發(fā)現(xiàn)光照促進(jìn)Epcs的動(dòng)員，證明光療能促進(jìn)Epcs在循環(huán)中富集，并能影響Epcs的生物學(xué)特性，而在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)光療后，Epcs的遷移和成管能力也會(huì)增加[38]。Epcs還與糖尿病有關(guān)，Epcs參與了內(nèi)皮功能障礙和新生血管的形成，故內(nèi)皮祖細(xì)胞功能紊亂可能是糖尿病引發(fā)的血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)。許多研究中表明糖尿病患者的Epcs功能受損[39]，故目前很多糖尿病治療的研究都著力于恢復(fù)Epcs功能上，Cao等[20]用含西花黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)糖尿病小鼠骨髓來源的Epcs，發(fā)現(xiàn)原本受損傷的Epcs的活力，遷移能力以及eNOS生成能力均得到恢復(fù)，他們認(rèn)為西花黃素有望作為潛在的治療糖尿病的藥物。Simin 等[40]發(fā)現(xiàn)胰島素聯(lián)合二甲雙胍治療能促進(jìn)糖尿病病人的Epcs進(jìn)入循環(huán)的量，同時(shí)伴有Epcs增殖、遷移、分泌、克隆和成管活性的增加，從而保護(hù)了糖尿病患者的血管，胰島素是一種對Epcs至關(guān)重要的生長因子，它能刺激內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成，修復(fù)內(nèi)皮損傷。但二甲雙胍需與胰島素共同作用，僅使用二甲雙胍則會(huì)抑制血管形成，降低血清中VEGF的量。

5 展望

與Epcs相關(guān)的研究仍在繼續(xù)開展，希望未來能有更多更有效的細(xì)胞因子、信號(hào)通路及其他藥物被發(fā)現(xiàn)，具體機(jī)制也能被研究的更清楚，以使內(nèi)皮祖細(xì)胞實(shí)現(xiàn)在體外高效擴(kuò)增，生物學(xué)特性得到顯著增強(qiáng)，與它有關(guān)的疾病能得到更好的改善甚至治愈，Epcs亦可以運(yùn)用到更多的領(lǐng)域中。