王木蘭，陳姣姣，郁 晨，馬全鑫，徐松濤，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥科學(xué)院/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2017年全球糖尿病患者約有4.25億人，預(yù)測到2045年，全球?qū)?.29億人患有糖尿病[1]。糖尿病會引起多組織多臟器的并發(fā)癥，如糖尿病腎病，糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病性腦血管病(diabetic encephalopathy，DE)等，DE是糖尿病并發(fā)癥中較嚴(yán)重且常見的一種，致殘率高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。DE的病變特征包括顱內(nèi)大血管和微血管病變，顱內(nèi)大血管的病變主要為血管狹窄、閉塞，微血管病變則表現(xiàn)為基底膜增厚、滲透性增加和微循環(huán)障礙等[2]。

目前關(guān)于DE動物模型的發(fā)病特點(diǎn)和機(jī)制研究較少，尋找與人類發(fā)病機(jī)制類似、病理特點(diǎn)相近的動物模型至關(guān)重要。Zucker糖尿病肥胖(zucker diabetes fatty,ZDF)大鼠具有肥胖、胰島素抵抗、脂質(zhì)紊亂及糖耐量異常等代謝綜合征，前期表現(xiàn)為高胰島素血癥，后期胰島β細(xì)胞功能衰竭，與人類2型糖尿病發(fā)病進(jìn)程相似，以微血管并發(fā)癥為主要病變特征，常用于糖尿病及其并發(fā)癥的研究[3-4]。本文利用磁共振成像技術(shù)、病理組織學(xué)和分子生物學(xué)方法，觀察ZDF大鼠DE的病理特點(diǎn)并初步探討其發(fā)病機(jī)制，為ZDF大鼠用于DE的研究提供實驗基礎(chǔ)和參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級8～9周齡雄性ZDF大鼠及同周齡的雄性瘦型(zucker lean, ZL)大鼠各8只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2016-006]；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心屏障實驗室[SYXK(浙)2018-0012]，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，光照：12 h/12 h 明暗交替，噪聲<50 dB；在 IVC籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由飲食。所有動物實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理審查委員會審核通過(編號: IACUC-20180502-01)。

1.2 主要試劑與儀器

血糖檢測試劑，購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測試劑，購自愛爾蘭Trinity Biotech 公司；蘇木色精，購自上海伯奧生物科技有限公司；曙紅Y，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生物素山羊抗大鼠IgG抗體，購自美國Immunoway公司；ALB和IgG抗體，購自美國Santa Cruz公司；ZO-1與Occludin抗體，購自美國Affinity公司；Mounting Medium With DAPI，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

7020全自動生化分析儀(日本，日立公司)；Discovery750超導(dǎo)磁共振掃描儀(美國，GE公司)；HM335E 半自動石蠟切片機(jī)(德國，Microm公司)；Nana Zoomer 2.0RS 數(shù)字切片掃描設(shè)備(日本，濱松公司)；自動染色機(jī)(德國，Leica公司)；H-7650 透射電子顯微鏡(日本，日立公司)；VS120-S6-W數(shù)字病理切片(熒光)掃描分析儀(日本，Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立

取8～9周齡雄性 ZDF 大鼠8只，飼喂 Purina#5008飼料，連續(xù)飼喂12周；另取8只同周齡雄性ZL大鼠飼喂普通飼料，作為正常對照組。ZDF大鼠每籠2只，ZL大鼠每籠4只。

1.3.2 一般狀態(tài)觀察

造模結(jié)束后，進(jìn)行Y迷宮實驗，具體方法為：實驗過程包含訓(xùn)練期與測試期，大鼠均由起始臂放入。訓(xùn)練期時，用擋板將新異臂隔開，大鼠在起始臂和其他臂內(nèi)自由活動10 min后，放回IVC籠內(nèi)。1 h后進(jìn)行測試，去掉新異臂擋板，大鼠可在3個臂中自由活動5 min。攝像記錄5 min內(nèi)大鼠在新異臂內(nèi)停留的時間。具體實驗操作參照竇萌萌[5]論文中的實驗方法學(xué)，定量分析：大鼠對新異臂的探索時間/總時間(5 min)×100%。

禁食不禁水10 ～12 h，稱取體重，并通過頜下取血，采集全血測定糖化血紅蛋白(HbA1c)；分離血清，檢測空腹血糖(fasting blood sugar, FBS)。

1.3.3 磁共振血管成像

對大鼠進(jìn)行磁共振血管成像(magnetic resonance angiography，MRA)掃描。具體方法如下[6]：大鼠麻醉后行俯臥位，采用GE Discovery750超導(dǎo)磁共振掃描儀與大鼠專用線圈。MRA用三維時間飛躍(3D time-of-flight，3D TOF)序列掃描，具體參數(shù)如下：重復(fù)時間(repetition time，TR)=31 ms，回波時間(echo time，TE)=4.9 ms，翻轉(zhuǎn)角(flip angle)=30°，層厚(slice thickness)=0.6 mm，視野(field of view，F(xiàn)OV)=80 mm×100 mm，矩陣=384×256(frequency × phase)。

1.3.4 病理組織學(xué)觀察

腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，使用4%多聚甲醛灌注20 min，摘取腦組織，取一部分腦組織于10%中性甲醛中固定，用于常規(guī)病理和免疫熒光染色，另一部分腦組織取皮質(zhì)部腦組織，切成約1 mm3小塊6～8粒，置于2.5%的戊二醛中固定，用于透射電鏡切片制作。

48 h后取甲醛固定組織，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后制成石蠟切片，蘇木素-曙紅(HE)染色后光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織病理變化；對Alb、IgG、ZO-1和occludin蛋白進(jìn)行免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察不同蛋白的表達(dá)情況，并利用Image J軟件進(jìn)行定量分析，計算平均光密度。取戊二醛固定的腦組織樣本，依次經(jīng)過脫水、浸透、包埋及切片，枸櫞酸鉛染液中染色，透射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ZDF大鼠一般體征與行為學(xué)的變化

20周齡時，與正常對照組ZL大鼠比較，ZDF大鼠體重、FBS和HbA1c均顯著升高(P<0.01)；Y迷宮實驗中模型對照組ZDF大鼠在新異臂停留的時間顯著低于正常對照組(P<0.05)(圖1)。

注：與ZL大鼠比較，#P<0.05，##P<0.01。圖1 ZDF大鼠一般體征與行為學(xué)變化Note. Compared with ZL rats, #P<0.05，##P<0.01.Figure 1 The changes of general physical signs and behavior in ZDF Rats

2.2 ZDF大鼠腦血管形態(tài)學(xué)的改變

由磁共振血管成像圖可見，正常對照組大鼠椎動脈較粗壯，腦內(nèi)動脈清晰可見，未見狹窄、閉塞等現(xiàn)象；模型對照組大鼠椎動脈顯影與正常對照組無明顯區(qū)別，但腦內(nèi)動脈出現(xiàn)節(jié)段性狹窄，遠(yuǎn)端分支少且顯影差，部分出現(xiàn)血流中斷與遠(yuǎn)端不顯影等嚴(yán)重閉塞情況(圖2)。常規(guī)病理學(xué)觀察可見，與正常對照組相比，模型對照組大鼠腦血管管腔狹窄，神經(jīng)元數(shù)量減少且發(fā)生排列紊亂與核固縮等情況(圖2)。

圖2 ZDF大鼠腦內(nèi)大血管形態(tài)變化Figure 2 Histological changes of large vessels in the brain tissues of rats.HE staining

圖3 ZDF大鼠腦內(nèi)微血管形態(tài)變化Figure 3 Histological changes of cerebral microvessels of the ZDF rats

2.3 ZDF大鼠腦微血管超微結(jié)構(gòu)的改變

正常對照組ZL大鼠腦組織皮層微血管管腔較大，血管周邊有星形膠質(zhì)細(xì)胞附著，并存在少量髓鞘，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞器清晰可見，無明顯異常；模型對照組ZDF大鼠微血管發(fā)生嚴(yán)重閉塞，血管周圍神經(jīng)纖維水腫、線粒體退化缺失(圖3)。

2.4 ZDF大鼠腦血管滲透性的改變

免疫熒光染色結(jié)果可見，對照組ZL大鼠腦組織血管周圍無Alb和IgG表達(dá)，而ZDF大鼠腦組織血管周圍Alb和IgG有較多陽性表達(dá)(圖4A，4B)。通過定量分析可見，ZDF大鼠腦組織中Alb和IgG表達(dá)均顯著升高(P<0.01)(圖4C，4D)。

2.5 ZDF大鼠腦血管緊密連接蛋白的表達(dá)

免疫熒光染色結(jié)果可見，對照組ZL大鼠腦組織皮質(zhì)血管壁上均有較豐富的occludin和ZO-1蛋白表達(dá)，而ZDF大鼠腦組織血管壁occludin和ZO-1蛋白表達(dá)較少(圖5A，5B)。通過定量分析可見，ZDF大鼠腦組織中occludin和ZO-1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖5C，5D)。

3 討論

糖尿病患者發(fā)生腦血管病的風(fēng)險是非糖尿病患者的4～10倍，且為糖尿病患者死亡的重要因素[7]，而DE的診斷和發(fā)病機(jī)制尚不明確。疾病動物模型的建立和評價是研究疾病病理特點(diǎn)和治療手段的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尋找與人類DE致病因素相似且符合DE發(fā)病特點(diǎn)規(guī)律的動物模型至關(guān)重要，但目前關(guān)于DE動物模型的觀察和評價研究并不系統(tǒng)、完善。本文通過行為學(xué)、影像學(xué)、病理和分子生物學(xué)實驗對ZDF大鼠DE的病理特點(diǎn)進(jìn)行了評價，并對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了探討。

認(rèn)知功能障礙是DE的主要病癥之一，本課題研究者利用Y迷宮實驗對ZDF大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行了評價。評價嚙齒類動物的認(rèn)知功能障礙常用Morris水迷宮的方法，但ZDF大鼠生性好靜懶動且肥胖，水迷宮實驗時常常浮于水面，不配合實驗，因此本實驗采用Y迷宮實驗，利用動物對新環(huán)境的探索本能評價ZDF大鼠的認(rèn)知功能，實驗過程中對動物無傷害、無刺激，且操作簡便[8-9]。大鼠在每個臂停留的時間理論上應(yīng)為33%左右，但由于大鼠對新環(huán)境的探索，在新異臂停留的時間會上升，但記憶力下降時，大鼠對新異臂的探索時間下降[10]。本實驗結(jié)果顯示，正常對照組大鼠平均對新異臂探索時間為39.2%，而模型對照組大鼠在新異臂停留時間下降，提示ZDF大鼠已發(fā)生認(rèn)知功能障礙和記憶能力損傷。

MRA是一種無創(chuàng)性、基于磁共振成像的血管成像技術(shù)。MRA可生成動脈和少量的靜脈的圖像，以評估它們的狹窄、閉塞、動脈瘤或其他異常[11]。在本實驗中，ZL大鼠腦內(nèi)血管輪廓清晰、粗壯，而模型

注：A：大鼠腦皮質(zhì)組織Occludin免疫熒光染色；B：大鼠腦皮質(zhì)組織ZO-1免疫熒光染色；C：大鼠腦皮質(zhì)組織中Occludin表達(dá)的變化；D：大鼠腦皮質(zhì)組織中ZO-1表達(dá)的變化。 與ZL 大鼠比較，#P<0.05，##P<0.01.圖5 ZDF大鼠腦組織中Occludin和ZO-1的表達(dá)Note. Compared with the ZL rats, #P<0.05，##P<0.01.Figure 5 Expression of occludin (A,C) and ZO-1 (B,D) in the brain tissue of ZDF rats.Immunofluorescence staining

組大鼠腦血管發(fā)生明顯的節(jié)段性狹窄和部分閉塞，提示在代謝紊亂的環(huán)境下，ZDF大鼠腦內(nèi)大血管已發(fā)生病變，通過常規(guī)病理學(xué)觀察，進(jìn)一步證實了ZDF大鼠腦內(nèi)大血管出現(xiàn)狹窄。

透射電鏡可觀察毛細(xì)血管狀態(tài)和周圍神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠腦組織微血管出現(xiàn)嚴(yán)重閉塞，血管周圍神經(jīng)纖維水腫、線粒體退化、缺失。推測可能是由于局部供血不足引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致ZDF大鼠認(rèn)知功能障礙。

Alb是哺乳動物中最豐富的血液蛋白質(zhì)，IgG由漿細(xì)胞產(chǎn)生，是血清和細(xì)胞外液中含量最高的一類免疫球蛋白。正常情況下兩者均不能通過血-腦屏障(blood-brain barrier, BBB)，但在高血糖、高血脂、胰島素抵抗等病理因素條件下，BBB通透性增加，導(dǎo)致Alb和IgG從血液穿過BBB進(jìn)入腦組織[12-13]。本實驗中，由免疫熒光染色結(jié)果可見，正常對照組大鼠腦血管附近幾乎無Alb和IgG滲出，而模型對照組大鼠腦血管發(fā)生嚴(yán)重的Alb和IgG滲漏，說明ZDF大鼠BBB通透性增加。有研究顯示，糖尿病動物模型血腦屏障通透性的增加和認(rèn)知功能的降低與糖尿病的嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性[14]，這與本研究結(jié)果一致。

BBB的屏障特性顯著依賴于相鄰細(xì)胞之間的緊密連接[15-16]。因此，ZDF大鼠腦組織中ALB滲漏可能與緊密連接蛋白表達(dá)水平有關(guān)。組成緊密連接的蛋白質(zhì)至少有40種，包括跨膜蛋白Occludin和細(xì)胞質(zhì)蛋白[17]。ZO-1是一種與緊密連接相關(guān)的外周膜蛋白，它具有交聯(lián)和固定緊密連接鏈蛋白支架的作用[18]。本實驗通過腦組織免疫熒光定量分析后發(fā)現(xiàn)，正常對照組ZL大鼠腦血管壁上有豐富的Occludin和ZO-1蛋白表達(dá)，但模型對照組ZDF大鼠Occludin和ZO-1表達(dá)均顯著降低，提示ZDF大鼠腦血管緊密連接蛋白缺失，導(dǎo)致BBB通透性增加，進(jìn)而引起Alb滲漏和認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，20周齡的ZDF大鼠表現(xiàn)為典型的肥胖和高血糖狀態(tài)，出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，腦內(nèi)大血管狹窄、形變，微血管閉塞，周圍神經(jīng)纖維水腫，發(fā)病機(jī)制可能為緊密連接蛋白缺失導(dǎo)致BBB功能破壞，血管滲透性增加，從而產(chǎn)生血管形態(tài)和功能病變。