周曉旭，彭 俊，胡 海，張映輝，佟明華*，顧為望,*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510000； 2.南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院，廣州 510000；3.五邑大學(xué), 廣東 江門 529020)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胎兒娩出后立即結(jié)扎臍帶，無菌處理后放入生理鹽水中，充分洗凈臍動(dòng)靜脈內(nèi)的血液，剪成1～2 cm長度。用止血鉗和鑷子分離臍動(dòng)靜脈，外膜。剪碎臍帶成1 mm3大小的組織塊，用PBS清洗一遍，均勻放置在培養(yǎng)瓶中，加臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后換液，培養(yǎng)。取第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(經(jīng)家屬知情同意后取足月健康產(chǎn)婦的新生兒臍帶)

1.2 主要試劑與儀器

間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，丙酮酸鈉，ITS，抗壞血酸，脯氨酸，地塞米松，青鏈霉素(鉑晉生物)，TGF-β3(Peprotech)，透明質(zhì)酸(山東福瑞達(dá))，PTHrP(Peprotech)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(賽業(yè))，F(xiàn)BS(賽業(yè))，CD34，CD45，CD90，HLA-DR(BD)，RNA提取液(Servicebio)，HyPureTMMolecular Biology Grade Water(HyClone)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (Rox)(Roche)。

流式細(xì)胞儀(BD)，顯微鏡(Olympus)，離心機(jī)(Anke)，勻漿儀(賽維爾生物)，臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(DragonLab)，熒光定量PCR儀(ABI)，超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)，超微量分光光度計(jì)(Thermo)，標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀(青島富勒姆)，離心管(Axygen Biosciences)，CO2培養(yǎng)箱(NAPCO)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原：取第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，制成1×106～2×106/mL單細(xì)胞懸液，加抗體，避光20 min，PBS洗一遍，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志的測(cè)定。

成脂誘導(dǎo)分化：取P3HUC-MSCs，加入成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，油紅O染色。

寧波舟山港：初步測(cè)算，寧波舟山港約13%的美國航線箱量將受到影響。寧波舟山港集裝箱吞吐量中美國航線占比為17%，國際航線受影響程度約2.2%。

成骨誘導(dǎo)分化：P3HUC-MSCs，加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后，茜素紅染色。

1.3.2 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化

當(dāng)?shù)?代細(xì)胞融合到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化，獲得第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，計(jì)數(shù)。取5×105的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，250 r/min離心4 min。棄上清，加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，重懸后1000 r/min離心5 min，重復(fù)一遍。將所得的細(xì)胞沉淀用0.5 mL的成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸，重懸后離心1000 r/min離心5 min。離心完畢后，將離心管的管蓋擰松，置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分成7組進(jìn)行，見圖1。

圖1 誘導(dǎo)成軟骨分化的分組Figure 1 Groupping of the chondrogenic differentiation test

1.3.3 HE染色觀察

培養(yǎng)完成后，用4%多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟置于水中，蘇木素染色，伊紅染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.4 阿利新藍(lán)染色觀察

將培養(yǎng)后的樣品用4%多聚甲醛固定，石蠟切片脫蠟置水，阿利新藍(lán)染色，脫水封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.3.5 熒光定量PCR檢測(cè)

取出待檢測(cè)的樣，檢測(cè)標(biāo)志基因Ⅱ型膠原，X型膠原，SOX9，ACAN的基因表達(dá)量。用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物均由Servicebio公司合成，以ACTIN為參照基因，各基因引物序列見表1。數(shù)值由2-ΔΔCT計(jì)算得出。

表1 各基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

2.1.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長迅速，增殖能力良好，細(xì)胞呈“梭形”生長，隨著細(xì)胞大量生長后，細(xì)胞呈“旋渦狀”生長。見圖2。

圖2 人第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Bar=500 μm)Figure 2 The third-generation human umbilical cord mesenchymal stem cells

2.1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原后顯示，CD44和CD90為陽性，陽性率分別為99.69%和99.74%，CD34和HLA-DR的表達(dá)率是0.04%和0%，小于2%，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的定義。見圖3。2.1.3 成脂成骨誘導(dǎo)分化能力

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化后，經(jīng)油紅O染色，鏡下可見脂滴被染成橙紅色，見圖4。成骨分化后，經(jīng)茜素紅染色，鏡下可見鈣質(zhì)結(jié)節(jié)被染成紅色，見圖5。

2.2 不同細(xì)胞因子組合的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的能力

2.2.1 HE染色

通過G2組和G1組相比，G4組和G3組相比，誘導(dǎo)28 d比21 d形成的軟骨組織染色陽性區(qū)域增大，細(xì)胞增多，G6組G7組和G5組相比，G7組的陽性染色區(qū)域較大，G6組染色較深且分布均勻。培養(yǎng)21 d的三組相比，G1組染色陽性區(qū)域最小，細(xì)胞聚集在軟骨組織外圍，細(xì)胞最少，G3組較G1組染色陽性區(qū)域無明顯差別，細(xì)胞分布均勻，數(shù)量較G1組多，G5組較前兩組染色區(qū)域大，細(xì)胞較密集。培養(yǎng)28 d的四組相比，G2組染色分布不均，細(xì)胞數(shù)量較少， G4組G6組染色陽性區(qū)域無明顯差別，G4組有部分未染色，細(xì)胞較少分布較松散，G6組細(xì)胞多，分布均勻且密集，G7組染色區(qū)域較大，細(xì)胞較多。見圖6。

2.2.2 阿利新藍(lán)染色

阿利新藍(lán)染色檢測(cè)酸性黏多糖，結(jié)果同HE染色較一致。見圖7。

2.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

TGF-β3組和TGFβ3/HA組，培養(yǎng)28 d較21 d，COL2α1、COL10α1、SOX9、ACAN表達(dá)量上升。在TGFβ3基礎(chǔ)加入HA后，COL2α1、SOX9、ACAN的表達(dá)量增加。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再加入PTHrP后，和TGFβ3/HA組比較，COL2α1、SOX9、ACAN的表達(dá)量上升，COL10α1的表達(dá)量下降，G5組G3組、G6組G4組、G7組G4組、G7組G6組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明HA，PTHrP可以上調(diào)Ⅱ型膠原、SOX9、ACAN的表達(dá)量，降低COL10α1的表達(dá)量，且加入PTHrP兩周比加入一周效果更好。見圖8。

圖3 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式細(xì)胞檢測(cè)Figure 3 Human umbilical cord mesenchymal stem cells determined by flow cytometry

圖4 成脂分化圖(Bar=100 μm)Figure 4 Adipogenic differentiation

圖5 成骨分化圖(Bar=100 μm)Figure 5 Osteogenic differentiation

圖6 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞加入不同細(xì)胞因子組合后形成的軟骨組織的HE染色(Bar=200 μm)Figure 6 Morphology of the cartilage tissues in each group, formed by human umbilical cord mesenchymal stem cells combined with different cytokines. HE staining.

圖7 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞加入不同細(xì)胞因子組合后形成的軟骨組織的阿利新藍(lán)染色(Bar=200 μm)Figure 7 Morphology of the cartilage tissues formed by human umbilical cord mesenchymal stem cells in each group, combined with addition of different cytokines. Alcian blue staining.

注：兩兩相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.圖8 各組軟骨的基因表達(dá)量Note. Comparison between two groups，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.Figure 8 Expression of the chondrogenic genes in each group

3 討論

軟骨是由軟骨細(xì)胞、膠原和蛋白多糖組成，由于無血管、神經(jīng)及淋巴組織的特性，一旦損傷很難自我修復(fù)，一直是臨床亟待解決的難題。隨著組織工程技術(shù)和間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，已經(jīng)有很多實(shí)驗(yàn)研究表明干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的能力[3-4]。為了讓干細(xì)胞向軟骨定向分化，一般是在培養(yǎng)時(shí)加入細(xì)胞因子或利用生物支架等等，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β家族(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維樣生長因子(FGF)、甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrP)、Ⅱ型膠原透明質(zhì)酸支架[5-6]。本實(shí)驗(yàn)就是通過HE、阿利新藍(lán)染色以及測(cè)定Ⅱ型膠原、X型膠原、SOX9、ACAN的表達(dá)量來探討TGF-β3，HA及PTHrP三者對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的聯(lián)合作用。COLⅡ關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分，是檢測(cè)hUCMSCs向軟骨分化效果的指標(biāo)。ACAN是軟骨細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，基因表達(dá)和產(chǎn)物可用于評(píng)估軟骨形成[7]。COL2α1、ACAN的表達(dá)量高表明成軟骨分化的效果好。X型膠原是軟骨細(xì)胞肥大的標(biāo)志，會(huì)使軟骨細(xì)胞失去性能，進(jìn)一步分化導(dǎo)致肥大的軟骨細(xì)胞鈣化。SOX9是軟骨發(fā)育和成熟過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，多種信號(hào)通路在軟骨形成過程中調(diào)節(jié)S0X9的表達(dá)和活性[8-9]。

眾所周知，TGF-β3是經(jīng)典的成軟骨誘導(dǎo)因子，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)ECM的合成，在軟骨形成過程中起到重要的作用。從本實(shí)驗(yàn)中可以看出，只加入TGF-β3培養(yǎng)21 d就可以誘導(dǎo)hUCMSCs成軟骨分化，培養(yǎng)28 d時(shí)，形成的軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，酸性黏多糖增加，COL2α1、SOX9及ACAN的表達(dá)量增加。TGF-β3與TGFβR-Ⅱ結(jié)合，激活Smad蛋白信號(hào)通路，表達(dá)Ⅱ型膠原和SOX9[10-11]。

HA是一種酸性黏多糖，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的重要組成成分，有潤滑、保護(hù)和營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨的作用。在MSCs成軟骨分化的過程中，HA不僅可以用作支架材料，也可以作為調(diào)節(jié)因子。多項(xiàng)研究證實(shí)了HA可以促進(jìn)軟骨的形成[12-15]，主要是通過與一些細(xì)胞表面受體(CD44，CD168，RHAMM等)的相互作用[16-17]。本研究的結(jié)果也表明HA和TGF-β3有協(xié)同作用。在TGF-β3基礎(chǔ)上加入HA后，明顯可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，上調(diào)COL2α1，ACAN，SOX9的表達(dá)量，促進(jìn)軟骨生成的效果優(yōu)于單TGF-β3的效果，并且培養(yǎng)28 d效果也優(yōu)于21 d。

PTHrP是抑制軟骨細(xì)胞肥大的重要因素，而細(xì)胞肥大的特征之一就是COL-X的增多。本研究的結(jié)果表明PTHrP聯(lián)合TGF-β3/HA可以抑制COL-10α1的表達(dá)量，增加COL-2α1、SOX9、ACAN的表達(dá)量，并且PTHrP作用的時(shí)間也影響抑制細(xì)胞肥大的效果。在添加PTHrP的三組中，雖然從14 d或21 d使用1周的PTHrP，都能促進(jìn)軟骨生成，抑制細(xì)胞肥大，但聯(lián)合應(yīng)用TGF-β3，HA28天，在第14天時(shí)加入PTHrP一起培養(yǎng)再培養(yǎng)14 d的效果最好，COL-2α1、SOX9、ACAN的表達(dá)量最高，而COL-10α1的表達(dá)量最低。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，PTHrP通過與Ihh形成負(fù)反饋軸來調(diào)節(jié)軟骨分化，離開細(xì)胞周期變成肥大的軟骨細(xì)胞分泌Ihh誘導(dǎo)合成PTHrP，作用于PTH/PTHrP受體(PTH1R)，受體激活觸發(fā)幾種不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括Gαs/腺苷酸環(huán)化酶/環(huán)腺苷一磷酸(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)和Gαq/ 11 /磷脂酶Cβ/蛋白激酶C(PKC)等，抑制軟骨細(xì)胞持續(xù)肥大，使軟骨細(xì)胞保持增殖狀態(tài)，并且負(fù)反饋調(diào)節(jié)Ihh[18-19]。體外MSC在軟骨形成的第一天開始表達(dá)PTHrP，并且隨后下調(diào)PTHrP表達(dá)，伴隨著促進(jìn)肥大成熟[20]。當(dāng)PTHrP合成的水平降至一定程度時(shí)，軟骨細(xì)胞會(huì)停止增生并發(fā)生肥大[21]。KIM[22]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PTHrP可以促進(jìn)軟骨形成并抑制MSCs體外軟骨形成中的肥大，SOX9，GAG和COL-2α1的表達(dá)量增加，COL-10α1的表達(dá)量減少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。有研究表明SOX9會(huì)直接抑制軟骨細(xì)胞COL-10α1和VEGFA等的肥大基因表達(dá)[23-24]。猜測(cè)是PTHrP一定程度上通過上調(diào)SOX9，抑制COL-10α1的表達(dá)。但是也有研究者認(rèn)為PTHrP限制了軟骨細(xì)胞的分化和成熟。PTHrP選擇性抑制X型膠原的合成，對(duì)Ⅱ型膠原合成基本沒有影響，而合成X型膠原是軟骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志,提示PTHrP可抑制軟骨細(xì)胞成熟過程[25]。造成這種結(jié)果的不同主要考慮是由于使用PTHrP的劑量、分子量、時(shí)間等的不同引起的。只有N末端完整的PTH和PTHrP才能有效刺激聚集蛋白聚糖合成[26]。

綜上所述， TGF-β3，HA， PTHrP可以不同程度的促軟骨分化。本實(shí)驗(yàn)表明，這其中聯(lián)合應(yīng)用TGF-β3，HA 28 d，在第14天時(shí)加入PTHrP一起培養(yǎng)，這種組合方式促進(jìn)HUC-MSCs成軟骨分化效果最好，且能抑制細(xì)胞肥大。但缺乏相應(yīng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，下一步將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或進(jìn)一步研究其具體的信號(hào)通路。