宋姍姍，陳 昊，張 強，王永芳，聶艷紅*

(1.徐州醫(yī)科大學附屬連云港市第一人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222061； 2.連云港市第二人民醫(yī)院，江蘇 連云港 222023)

肺癌的發(fā)病率和死亡率位于全球惡性腫瘤的第一位，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) 占肺癌的85%，且多數(shù)患者在確診時已處于晚期[1]。靶向治療是NSCLC晚期患者的重要治療手段，雖然目前的分子靶向治療已使部分患者受益，但總體預后仍然較差，故尋找有效的分子靶標仍具有重要的臨床意義。Ras蛋白激活類似物1(ras protein activator like 1，RASAL1)和大鼠肉瘤蛋白活化因子2(ras protein activator like 2，RASAL2)均屬于RasGTP酶活化蛋白家族(GTPase-activating protein, RasGAP)中的GAP1家族的成員。RASAL1定位于人第12號染色體(12q24.13), 而RASAL2基因定位于人第1號染色體(1q25)，編碼的蛋白由1139個氨基酸組成。兩者均具有GTP酶的活性，能水解GTP為GDP使Ras蛋白失活，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移[2-3]。國內(nèi)外已有RASAL1和RASAL2在多種腫瘤中的研究報道[3-7]，但RASAL1和RASAL2在肺癌中的研究還較少。本文基于全球最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫Oncomine和生存相關的Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫的大數(shù)據(jù)信息，綜合分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表達及與生存預后的關系，為后期實驗及潛在的臨床價值提供指導。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫來源和方法

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org/)分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表達差異。登錄Oncomine數(shù)據(jù)庫首頁，設定條件：1)Gene:RASAL1/2; 2)Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis。進一步分析RASAL1/2在NSCLC中的表達：① Cancer Type: Non-Small cell Lung carcinoma; ②Data Type: mRNA; ③臨界值設定條件:Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%; ④其他為數(shù)據(jù)庫默認設定。最后勾選NSCLC相關研究進行compare的二次分析。

基于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析RASAL1和RASAL2與NSCLC患者臨床生存預后的關系。登錄Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫首頁，選擇肺癌頁面(Lung cancer)，設定條件: ①Gene:RASAL1/2; ②Split patients by: Auto select best cutoff; ③Survival: OS/PPS; ④Histology: adenocarcinoma/squamous cell carcinoma; ⑤勾選需要分析的分層指標；⑥其他為數(shù)據(jù)庫默認設定。

1.2 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。RASAL1和RASAL2在正常組織與NSCLC組織中的表達差異采用t檢驗。Kaplan-Meier模型分析RASAL1和RASAL2與NSCLC患者臨床生存預后之間的關系。

2 結果

2.1 RASAL1和RASAL2在NSCLC與正常組織中的表達差異

Oncomine 數(shù)據(jù)庫包含715個基因表達數(shù)據(jù)集和86733個樣本數(shù)據(jù)，其中RASAL1基因有549個數(shù)據(jù)集，樣本數(shù)據(jù)為72466個，RASAL2基因有641個數(shù)據(jù)集，樣本數(shù)據(jù)為78639個。Oncomine數(shù)據(jù)庫中，RASAL1基因有355項不同類型的研究結果，其中16項差異有統(tǒng)計學意義，4項表達增高，12項表達降低，RASAL1在肺癌中高表達；RASAL2基因有426項不同類型的研究結果，其中23項差異有統(tǒng)計學意義，表達增高的研究有13項，降低的有10項，RASAL2在肺癌中低表達。綜合分析11項(見附件參考文獻8-15)關于RASAL1在NSCLC組織與正常組織中表達的研究，發(fā)現(xiàn)RASAL1在NSCLC所有差異表達基因中的中位數(shù)排名是1614.0，P=2.38E-7，表明RASAL1在NSCLC中高表達(見圖1)。對RASAL2在NSCLC組織與正常組織中表達的17項研究[8，11，14-15]分析發(fā)現(xiàn)，在NSCLC所有差異表達基因中RASAL2的中位數(shù)排名是1486.0，P=0.013，表明RASAL2在NSCLC中低表達(見圖1)。另外，分析不同病理類型NSCLC組織中RASAL1和RASAL2的表達水平發(fā)現(xiàn)，RASAL1在NSCLC中均高表達，RASAL2均低表達(P<0.05，見表1，表2)。

注：A RASAL1在11項NSCLC過表達研究中的比較分析；B RASAL2在17項NSCLC低表達研究中的比較分析。顏色越深表示芯片中基因表達越高。圖1 RASAL1和RASAL2在Oncomine數(shù)據(jù)庫中NSCLC中的表達Note. A Comparison of RASAL1 across 11 analyses over-expression; B Comparison of RASAL2 across 17 analyses under-expression. The darker the color, the higher the gene expression in the chip.Figure 1 Expression of RASAL1 and RASAL2 in NSCLC in the Oncomine database.

病理類型Pathological types 相關研究References樣本量Sample size 差異倍數(shù)Difference multiplet值t valueP值P valueOkayama等[8]2464.27010.044<0.01Selamat等[9]1161.54910.836<0.01肺腺癌Lung adenocarcinomaSu等[10]661.7743.307<0.01Hou等[11]1561.5906.194<0.01Landi等[12]1071.2335.504<0.01大細胞肺癌Ding等[13]751.9853.726<0.01Large cell lung cancerHou等[11]1561.6423.797<0.01鱗狀細胞癌Hou等[11]1561.1331.824<0.01Squamous cell carcinomaHou等[11]1561.4716.454<0.01

表2 不同病理類型的NSCLC組織與正常組織中RASAL2的表達差異

2.2 RASAL1和RASAL2與NSCLC患者臨床預后的關系

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中RASAL1在NSCLC中的研究樣本為1926個，RASAL2的樣本為1145個，結果顯示RASAL1低表達組及RASAL2高表達組的NSCLC患者的生存預后較好。RASAL1低表達組和RASAL2高表達組患者的總生存時間(overall survival, OS)和復發(fā)后生存(post-progression survival, PPS)均顯著增高(P<0.05，RASAL1的HR分別為1.35、1.39，95% CI分別為1.19～1.54、1.05～1.83，RASAL2的HR分別為0.6、0.56，95% CI分別為0.49～0.72、0.35～0.88)。進一步亞型分析，低表達RASAL1的肺鱗狀細胞癌和肺腺癌患者及高表達RASAL2的肺腺癌患者的生存時間均顯著長于高表達組(HR分別為1.35、1.73、0.52，95% CI分別為1.03～1.78、1.34～2.23、0.4～0.67)，而RASAL2的表達與肺鱗狀細胞癌患者的生存預后無相關性。(圖2)。低表達的RASAL1與接受放化療的NSCLC患者的良好生存預后相關(樣本量分別為73、178，HR分別為2.12、1.59，95%CI為1.23～3.68、1.05～2.40)，與未接受放化療的患者的生存預后無關。而在RASAL2與NSCLC患者預后關系的研究中，接受放化療的研究的樣本例數(shù)較少，無法統(tǒng)計。此外，低表達的RASAL1和高表達的RASAL2與早期患者(I期和II期)的良好預后相關，在男、女及吸煙、不吸煙的患者中均與預后相關。而與分級和晚期(III期和IV期)患者的生存預后差異無統(tǒng)計學意義。

注：A～C： RASAL1在NSCLC、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌中；D～F： RASAL2在NSCLC、肺鱗狀細胞癌、肺腺癌中。圖2 RASAL1和RASAL2與NSCLC患者預后的關系Note. A-C: RASAL1 in NSCLC, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma. D-F: RASAL2 in NSCLC, squamous cell carcinoma, and lung adenocarcinoma.Figure 2 Relationship between RASAL1 and RASAL2 expressions and prognosis in patients with NSCLC

3 討論

NSCLC是肺癌最常見的病理類型，包括腺癌、大細胞癌和鱗狀細胞癌，但確診時多已錯失手術治療時間，故預后相對較差[16-17]。近年來，隨著生物標志物的不斷發(fā)現(xiàn)，靶向藥物的臨床應用，患者的生存預后有所改善[18-19]。但肺癌的高發(fā)病率及死亡率仍持續(xù)增長，故亟需尋找新的生物標志物以提高診斷、治療及預后評估[20]。

Ras是最早發(fā)現(xiàn)的人類癌基因，其失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。RASAL1和RASAL2作為Ras的調(diào)節(jié)基因，也與腫瘤的形成密切相關[21-22]。在胃癌中，Chen等[3]發(fā)現(xiàn)低表達的RASAL1能促進胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，顯示了RASAL1的抑癌作用。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)甲狀腺癌中的RASAL1同樣能抑制癌細胞的生長、遷移和侵襲。此外，在肝癌[6]、結直腸癌[24]等多種腫瘤中的研究均顯示RASAL1表達降低，從而促使腫瘤的發(fā)生，且低表達的RASAL1與不良預后相關。但尚未見RASAL1與NSCLC的相關報道。RASAL2在腫瘤中的研究尚存爭議，Hui等[5]發(fā)現(xiàn)，RASAL2在膀胱癌中抑制腫瘤的發(fā)生，但在肝癌中，RASAL2上調(diào)促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[25]。即使在同一種腫瘤或同一種腫瘤的不同分型中，RASAL2的研究結果也不同。在結直腸癌中，Jia等[4]研究表明，下調(diào)RASAL2能促進結直腸癌細胞的增殖，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，而Pan等[26]發(fā)現(xiàn)，RASAL2在結直腸的原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移癌中表達增加，且高表達的RASAL2與患者的不良預后相關。在乳腺癌中，伴隨RASAL2的失活，LuminalB型乳腺癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[27]，但過表達的RASAL2對三陰性乳腺癌起促侵襲和轉(zhuǎn)移的作用[28]。目前，關于RASAL2在肺癌中的研究，僅報道了其對肺腺癌的抑制作用[29]。鑒于此，我們通過生物數(shù)據(jù)庫分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表達差異及與患者臨床生存預后的關系，為進一步研究RASAL1和RASAL2在NSCLC中的作用提供參考和理論依據(jù)。

利用Oncomine數(shù)據(jù)庫檢索RASAL1基因發(fā)現(xiàn)：共12項研究，包括腦、食管和頭頸部等多部位的腫瘤，顯示RASAL1低表達；共4項研究，包括結直腸癌、卵巢癌及肺癌組織，顯示RASAL1高表達。RASAL1在NSCLC組織中的研究共11項，對其二次分析發(fā)現(xiàn)，RASAL1在NSCLC中的表達較正常組織增加。RASAL1在肺癌中的表達與已報道的在其他腫瘤中的表達結果相反，可能是由于組織特異性導致的，這與數(shù)據(jù)庫中分析的RASAL1在不同部位腫瘤中的表達不同相符，也可能是樣本量小導致的誤差，具體原因及機制還有待于大量實驗驗證。RASAL2基因的數(shù)據(jù)集有641個，樣本數(shù)為78639個，有統(tǒng)計學差異的研究有23項。23項研究中，包括結直腸癌、食管癌、腎臟腫瘤及肺癌等多部位共10項研究顯示RASAL2表達降低，在乳腺癌、結直腸癌及胃癌等多部位共13項研究顯示RASAL2表達增加。RASAL2在結直腸癌中的文獻報道既有高表達的也有低表達的，這與數(shù)據(jù)庫的結果符合，猜測RASAL2的表達差異可能與腫瘤亞型相關。對17項關于NSCLC組織和正常組織中RASAL2的研究深入分析發(fā)現(xiàn)，RASAL2在NSCLC中表達降低，這與Li等[29]的研究結果一致。綜上，我們得出RASAL1和RASAL2的表達在不同腫瘤中存在差異，在同一腫瘤中可能還與腫瘤亞型相關；在NSCLC中，RASAL1表達增加，RASAL2表達降低。Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析表明，低表達的RASAL1和高表達的RASAL2與NSCLC患者的良好預后相關，結合RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表達水平，猜測RASAL1可能在NSCLC中起促進癌發(fā)生的作用，而RASAL2可能作為抑癌基因而存在。進一步分析，RASAL1在鱗癌和腺癌中均與患者預后相關，RASAL1的表達可能不與NSCLC的病理類型相關；RASAL2只在腺癌中與患者生存預后相關，RASAL2可能與NSCLC的病理類型相關，亦或樣本量小(271個樣本)引起的實驗誤差。此外，低表達的RASAL1與接受放化療的NSCLC患者的良好預后相關(RASAL2樣本量小無法分析)，表明RASAL1可能是潛在的治療靶點；RASAL1和RASAL2在早期患者中的表達與生存預后相關，表明其可能在疾病的早期發(fā)揮作用，但仍需大量的研究來驗證。

總之，在NSCLC中，RASAL1高表達，RASAL2低表達，且低表達的RASAL1和高表達的RASAL2與早期患者良好的臨床預后相關，故猜測RASAL1在NSCLC的早期形成中可能起促進作用，RASAL2起抑制作用。RASAL1對NSCLC患者預后的影響還與放化療相關，其可能是改善輔助治療的重要靶點。RASAL1和RASAL2可能是NSCLC診斷、治療及預后評估的潛在生物標志物，但限于數(shù)據(jù)庫的研究范圍及樣本量，上述猜測還有待于進一步的研究。