李佳璐，劉俊亭，袁慧雅*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽 110122； 2.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，沈陽 110122)

我國是腎病大國，腎病已經(jīng)逐漸成為人類健康的新殺手，其發(fā)病率、患病率逐年升高。根據(jù)病情進(jìn)展速度，腎衰可分為急性腎衰(acute renal failure, ARF)和慢性腎衰(chronic renal failure,CRF)兩種。急性腎衰，是以患者腎功能在數(shù)小時(shí)至幾天之內(nèi)發(fā)生急劇變化，導(dǎo)致腎排出氮質(zhì)代謝廢物的能力及維持體內(nèi)水、電解質(zhì)穩(wěn)定功能的喪失為特征的急性腎臟病變。慢性腎衰，主要表現(xiàn)為長時(shí)間，進(jìn)行性的腎單位損傷，繼而引發(fā)腎排泄功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變出現(xiàn)氮質(zhì)代謝物潴留，最終使機(jī)體代謝異常。根據(jù)美國的K/DOQI指南(Kidney Disease Outcome Quality Initiative 腎臟病預(yù)后質(zhì)量指南)指出：CRF的4期，人群的發(fā)病率分別為3.0%、4.3%、0.2%、0.1%[1]。

研究腎病的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)出安全有效的藥物一直是臨床腎病領(lǐng)域中重要的課題。藥物的臨床前的研究主要以受試藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)形式出現(xiàn)，即建立動(dòng)物模型，然后進(jìn)行發(fā)病機(jī)理或干預(yù)(藥學(xué))試驗(yàn)研究。多年來，腎病研究者以大鼠作為研究對象，逐步開發(fā)出若干典型的適用于不同腎病種類研究需求的動(dòng)物模型，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 慢性腎功能衰竭

臨床上，根據(jù)病史，腎功能檢查以及相關(guān)臨床表現(xiàn)等可以診斷慢性腎衰。目前國際公認(rèn)的分期是依據(jù)腎臟病預(yù)后質(zhì)量倡議(K/DOQI)所制定的，共分為5期。根據(jù)慢性腎衰竭的病程進(jìn)展，可分為：腎功能代償期，腎功能失代償期，腎功能衰竭期和尿毒癥期。慢性腎衰竭的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為有以下幾個(gè)原因：(1)腎單位高灌注，高濾過；(2)腎單位高代謝；(3)腎組織上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用；(4)細(xì)胞因子和生長因子促纖維化的作用；(5)其他。通過模擬臨床上的常見發(fā)病機(jī)制，可以制備出符合臨床需要的大鼠腎衰實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.1 大鼠CRF常用造模方法簡述

建立符合科研設(shè)計(jì)需求的CRF動(dòng)物模型，對研究的開展具有重要的意義。大鼠CRF常用造模方法可分為物理法和化學(xué)法。在造模與后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，操作者應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予人道的關(guān)懷。

1.1.1 物理法

(1)大鼠腎大部分切除法(約5/6)：成年雄性 SD 大鼠，結(jié)扎左側(cè)腎上下級腎組織各約 1/3, 復(fù)位腎, 縫合。一周后同樣方式切除整個(gè)右腎, 兩次手術(shù)共切除5/6的 腎[2]。進(jìn)而測定腎大部切除后大鼠尾靜脈血的尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)的值。

(2)腎動(dòng)脈分支的部分結(jié)扎方法：成年雄性SD大鼠。在手術(shù)顯微鏡下分離腎動(dòng)脈，保留左腎數(shù)支動(dòng)脈中的一支，結(jié)扎左腎其余動(dòng)脈分支，造成相當(dāng)于2/3腎梗死，一周后切除右腎[3]。隨后測定大鼠尾靜脈血的BUN、Scr的值。

(3)冷凍加切除法：成年雄性SD大鼠。作背左側(cè)切開，分離暴露左腎。預(yù)先浸入液氮瓶的冷刀一次在動(dòng)物左腎上下極及外側(cè)前后四個(gè)部位冷凍，每次冷凍40 s后復(fù)位腎。2周后行二期手術(shù)，切除右腎。待模型穩(wěn)定后，行血液生化測定[4]。

1.1.2 化學(xué)法

(1)腺嘌呤模型：雄性SD大鼠，以腺嘌呤250 mg/(kg.d)灌胃，每周收集24 h尿液，每2周尾靜脈取血進(jìn)行生化測定[5]。

(2)阿霉素模型：SD雄性大鼠，一次性陰莖內(nèi)靜脈注射阿霉素6.0 mg/kg，自由攝食飲水，收集24 h尿液[6]。

1.2 大鼠CRF常用造模方法比較

根據(jù)動(dòng)物模型的病理學(xué)特點(diǎn)，評價(jià)各模型的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)。同時(shí)對各模型的應(yīng)用進(jìn)行分析與比較，列出各個(gè)模型所適合的科研領(lǐng)域，期待可以為進(jìn)一步的研究提供一定的參考。

1.2.1 物理法

(1)大鼠腎大部分切除法

模型評價(jià)：本模型以腎小球肥大，硬化為主要特點(diǎn)，符合腎小球高度濾過致腎衰學(xué)說。優(yōu)點(diǎn)是有較好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，可避免壞死的腎組織保留在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)；可通過改變腎切除的量對發(fā)生腎衰的時(shí)間進(jìn)行控制，滿足不同實(shí)驗(yàn)的需要。缺點(diǎn)是需兩期手術(shù)，模型制備時(shí)間長，易出血，誘發(fā)動(dòng)物死亡。

科研應(yīng)用：可用于臨床上CRF治療相關(guān)藥物的研究。(例如，減輕腎組織灌注以及腎高濾過，抑制系膜細(xì)胞增殖，抗氧化作用，降壓等方面的藥物的研究)。中醫(yī)研究方面，通過觀察黑地黃丸對5/6腎切除CRF大鼠腎功能影響,探討黑地黃丸改善CRF大鼠腎功能的最佳用藥劑量[7]。基因表達(dá)方面，報(bào)道了SD大鼠腎衰竭模型BMP-7和TGF-β_1表達(dá)水平分析及藥物干預(yù)效應(yīng)研究[8]。Heiss等對慢性腎病大鼠骨骼肌缺血的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)遲鈍等問題進(jìn)行了深入研究，為破解相關(guān)致病基因?qū)ふ倚碌姆较騕9]。

(2)腎動(dòng)脈分支的部分結(jié)扎方法

模型評價(jià)：本方法復(fù)制的模型與大鼠腎大部切除術(shù)相似。優(yōu)點(diǎn)是可明顯地改善手術(shù)的出血情況。缺點(diǎn)是對實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的要求較高，步驟復(fù)雜。術(shù)后，動(dòng)物模型高血壓顯著，腎病理損傷嚴(yán)重。采用率不如大鼠腎大部切除術(shù)高。

科研應(yīng)用：適用于藥物治療不同程度CRF時(shí)，藥物劑量，療效的評價(jià)與基因表達(dá)的研究。如，應(yīng)用于研究PPARγ、NF-κB、TNF-α在慢性缺血性腎病大鼠模型中的表達(dá)及意義[10]。也應(yīng)用于MG-132對慢性腎衰大鼠治療作用[11]和慢性腎衰竭大鼠主動(dòng)脈NF-κB的表達(dá)變化的一系列初步研究[12]。

(3)冷凍加切除法

模型評價(jià)：本模型的病理組織改變?yōu)槟I小球肥大，玻璃樣變性及硬化，系膜基質(zhì)增生肥厚。優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作簡便，無出血風(fēng)險(xiǎn)，彌補(bǔ)了腎大部切除法的不足。缺點(diǎn)是對設(shè)備要求高，難以實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化。

科研應(yīng)用：適用于臨床上對CRF藥物治療以及篩選方面的研究。但由于設(shè)備的限制，應(yīng)用較少，且冷凍法多用于腎臟腫瘤的治療。可應(yīng)用此模型研究苯那普利、氯沙坦在冷凍致慢性腎衰模型的療效比較[13]。

1.2.2 化學(xué)法

(1)腺嘌呤模型

模型評價(jià)：本模型的病理組織改變以腎小管破壞為主要特征，小管上皮細(xì)胞水腫，壞死，并伴發(fā)梗阻，導(dǎo)致腎單位大量喪失?？勺鳛檠芯磕I功能衰竭以及腎纖維化的良好模型。本模型制作方法簡單，造模周期短，實(shí)驗(yàn)可控性強(qiáng)。

科研應(yīng)用：可用于評價(jià)腎小管功能恢復(fù)藥物的療效。中醫(yī)方面，研究發(fā)現(xiàn)真五湯(ZWT)提取物對腺嘌呤所致大鼠慢性腎功能衰竭的改善作用[14]。應(yīng)用此模型考察扶正泄?jié)犸媽ο汆堰手麓笫舐阅I衰竭腎功能影響[15]?；虮磉_(dá)方面，用于研究蟲草多糖對腺嘌呤誘導(dǎo)的慢性腎衰模型大鼠TGF-β1、MCP-1及mRNA表達(dá)的影響[16]。

(2)阿霉素模型

模型評價(jià)：阿霉素可損害腎近曲小管上皮細(xì)胞，使其脫離，并與管腔內(nèi)的蛋白質(zhì)和其他細(xì)胞成分融合成管型，堵塞管腔，使腎內(nèi)壓增高，產(chǎn)生損傷。

優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)方法簡便易行，可操作性高。

科研應(yīng)用：此類模型對于篩選擴(kuò)張腎小管，降低腎小管壓力，改善蛋白尿等方面的藥物療效具有重要的指導(dǎo)作用?？捎糜谘芯坑嘘P(guān)骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)與氯沙坦對于阿霉素型腎病模型的治療效果的相關(guān)研究療效[17]。

2 急性腎衰模型

急性腎衰ARF是由各種病因引起的腎功能快速下降而出現(xiàn)的臨床綜合征。根據(jù)病因發(fā)生的解剖部位可以分為：腎前性，腎性，腎后性。腎前性ARF指因各種原因引起腎實(shí)質(zhì)血流灌注減少，導(dǎo)致GFR降低和腎小球?yàn)V過減少，約占ARF的55%。腎性ARF指出現(xiàn)腎實(shí)質(zhì)損傷，以腎缺血和腎毒性藥物或毒素導(dǎo)致的急性腎小管壞死(ATN)最為常見，其他還包括急性間質(zhì)性腎炎(AIN)，腎小球疾病和腎血管疾病等，約占ARF的40%。腎后性ARF系尿路感染所致，梗阻可發(fā)生在從腎盂到尿道的尿路中任何部位，約占ARF的5%。在過去的半個(gè)世紀(jì)中急性腎功能衰竭被認(rèn)為是由腎缺血引起的血液動(dòng)力學(xué)疾病，而這一觀點(diǎn)的建立正是源于動(dòng)物模型的發(fā)現(xiàn)[18]。

2.1 ARF常用造模方法簡述

近年來，通過臨床上對不同ARF患者的追蹤研究，ARF的病因謎團(tuán)被不斷地揭開，也推動(dòng)了多種大鼠急性腎衰模型方法的建立。

2.1.1 物理法

(1)一側(cè)腎缺血/再灌注加對側(cè)腎切除：雄性SD大鼠，切除右腎。同時(shí)阻斷左側(cè)腎動(dòng)脈45 min,再灌注24 h，建立大鼠缺血性急性腎衰竭的動(dòng)物模型。測定各組大鼠腎組織和血漿SOD活性、MDA含量及腎組織中NO的含量[19]。

(2)部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈模型：雄性SD大鼠，摘除右腎，左輸尿管內(nèi)插入PE-10導(dǎo)管，部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈,60 min后解除結(jié)扎線，按實(shí)驗(yàn)預(yù)訂時(shí)間分別采血作血液生化測定[20]。

2.1.2 化學(xué)法

(1)甘油型：SD雄性大鼠，禁水24 h，給予50%甘油生理鹽水10 mg/kg。雙后肢注射，構(gòu)建模型，定時(shí)采血，進(jìn)行尿素氮的測定[21]。

(2)油酸型：選用Wistar雄鼠，通過左腎動(dòng)脈注射油酸(0.15 mL/kg)，定時(shí)采血作生化測定[22]。

(3)氯化汞型：選用成年大鼠，一次性腹腔注射順鉑，采血測定血液生化指標(biāo)[23]。

(4)氨基糖苷類型：選用Wistar雄鼠，腹腔注射慶大霉素140 mg/kg(也可選用卡那霉素),連續(xù)注射7 d。建立慶大霉素模型[24]。

(5)蛇毒誘導(dǎo)：成年雄性SD大鼠，在大鼠的尾部消毒后,從尾靜脈注射五步蛇毒，根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算出注射劑量,采血作血液生化測定[25]。

(6)氟化鈉誘導(dǎo)：成年大鼠，經(jīng)口按135 mg/kg體重的劑量一次性灌服氟化鈉，作相關(guān)尿液生化指標(biāo)測定[26]。

(7)順鉑誘導(dǎo)：陳小波等[27]報(bào)道雄性SD大鼠戊巴比妥鈉麻醉，以順鉑(CP)6 mg/kg單次尾靜脈注射，從而制備腎毒性 ARF動(dòng)物模型。

2.2 大鼠ARF常用造模方法對比

同樣地按上述方法，對大鼠ARF模型也進(jìn)行相應(yīng)的比較分析。

2.2.1 物理法

(1)一側(cè)腎缺血/再灌注加對側(cè)腎切除

模型評價(jià)：本模型采用外科手術(shù)的方法使模型動(dòng)物腎血供受阻，引發(fā)腎功能損傷，細(xì)胞缺血缺氧，最終造成腎小管上皮細(xì)胞損傷,誘發(fā)急性腎衰。結(jié)果導(dǎo)致模型大鼠腎組織中SOD 含量下降，MDA含量顯著上升。

科研應(yīng)用：該模型常用于研究臨床上ARF的發(fā)病機(jī)制以及氧自由基清除劑對ARF防治作用方面的探究。應(yīng)用本模型，通過使用對比增強(qiáng)超聲，來評估急性腎充血大鼠模型中的腎灌注損傷[28]。孫倩倩應(yīng)用次模型探究了EPO后處理抗大鼠腎缺血再灌注損傷作用及機(jī)制研究[29]。

(2)部分結(jié)扎腹主動(dòng)脈模型

模型評價(jià)：本模型屬于持續(xù)低灌注型ARF。鏡下切片組織處，觀察到腎小管上皮細(xì)胞彌漫性腫脹，有少量腎小管小灶性壞死，管腔內(nèi)可見管型，腎間質(zhì)明顯水腫。缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜，術(shù)中易出血。

科研應(yīng)用：本方法建立的低灌注ARF模型與臨床患者的實(shí)際情況更為相似，可以用于聯(lián)合多臟器，研究多臟器共同影響病情的作用機(jī)制。王建萍應(yīng)用此模型研究了奧美沙坦對腹主動(dòng)脈結(jié)扎左心室肥厚大鼠腎的保護(hù)作用[30]。

2.2.2 化學(xué)法

(1)甘油型

模型評價(jià)：甘油具有高滲性，會(huì)導(dǎo)致局部肌肉的變性壞死，引起血管內(nèi)溶血，誘導(dǎo)腎血管收縮，導(dǎo)致腎血流量和腎小球?yàn)V過率二者都下降，引起腎小管的損傷。該模型經(jīng)濟(jì)成本低，方法簡單，病變較穩(wěn)定，可進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。

科研應(yīng)用：本模型具有腎缺血和內(nèi)源性毒性物質(zhì)兩種有害物質(zhì)可對腎造成雙重的損傷。Nagano等[31]對肝細(xì)胞生長因子(HGF)對甘油誘導(dǎo)的急性腎功能衰竭的預(yù)防進(jìn)行了詳細(xì)的研究。應(yīng)用此模型也研究了腎衰合劑防治大鼠急性腎衰竭的實(shí)驗(yàn)研究[32]。

(2)油酸型

模型評價(jià)：注射油酸致大鼠腎上皮細(xì)胞發(fā)生腫脹、壞死，間質(zhì)水腫，模型動(dòng)物的血BUN顯著升高，引發(fā)腎內(nèi)血管缺血以及嚴(yán)重的微循環(huán)障礙，使得腎排泄功能衰竭。該實(shí)驗(yàn)方法簡便易行。

科研應(yīng)用：此模型模擬的是人類起源于腎微循環(huán)障礙的缺血性ARF方面的研究，有助于更深一步了解急性腎衰發(fā)病時(shí)腎微循環(huán)的變化。吳廣禮等運(yùn)用該種模型對“樟柳堿，東莨菪堿，山莨菪堿”這三種莨菪藥物對腎衰的保護(hù)作用進(jìn)行了研究[33]。

(3)氯化汞型

模型評價(jià)：注射氯化汞后，腎血流量下降，SCr水平升高，BUN水平升高，肌肝清除率降低，肌肝，尿素氮總排出量顯著減少。低劑量汞中毒時(shí)，表現(xiàn)為腎近曲小管直部上皮細(xì)胞的壞死，而大劑量汞中毒時(shí)，近曲小管其他節(jié)段也可發(fā)生壞死。本模型制備方法簡單，病變較為穩(wěn)定。

科研應(yīng)用：可用于研究由于重金屬Hg中毒時(shí)引起的腎損傷。劉翔等,應(yīng)用此模型研究了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對大鼠急性腎小管損傷修復(fù)的促進(jìn)作用，觀察了骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對氯化汞(HgCl2)導(dǎo)致的急性腎小管損傷有無治療作用，并探討了其可能的機(jī)制[34]。

(4)氨基糖苷類型

模型評價(jià)：藥物蓄積在腎小管處，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的功能發(fā)生紊亂以損傷腎小管。模型動(dòng)物尿中NAG酶及溶菌酶的排泄，明顯增多，血尿素氮和尿蛋白含量增多，發(fā)生急性腎小管壞死。實(shí)驗(yàn)操作簡單易行，且腎近曲小管上皮細(xì)胞的損傷可隨用藥時(shí)間而加重。

科研應(yīng)用：可用于臨床上氨基糖苷類抗生素致ARF的藥物防治方面相關(guān)的研究。應(yīng)用本模型探討急性腎衰大鼠腎組織中長鏈非編碼RNA linc00152的表達(dá)情況及其對急性腎衰的影響[35]。也可研究中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)和腎損傷分子(KIM-1)在慶大霉素誘導(dǎo)的急性中毒性腎衰竭模型中的表達(dá)，探討其對急性腎損傷早期診斷的應(yīng)用價(jià)值[36]。

(5)蛇毒誘導(dǎo)

模型評價(jià)：靜注毒液后，可造成模型動(dòng)物肌肉的直接損傷，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)大量血紅蛋白尿，使得腎小管發(fā)生阻塞，同時(shí)蛇毒又可激活機(jī)體內(nèi)的X因子和凝血酶，溶解破壞紅細(xì)胞，致血栓形成，從而導(dǎo)致腎的微循環(huán)被破壞。模型簡便易行，對于蛇毒中毒的研究有很大意義。

科研應(yīng)用：可利用本模型研究高壓氧輔助抗蛇毒血清治療對五步蛇中毒大鼠腎保護(hù)作用[37-38]。進(jìn)一步探究蛇毒中毒所致的一系列腎損傷。

(6)氟化鈉誘導(dǎo)

模型評價(jià)：造模方法簡單，氟化物對腎組織的損害程度為α-GST可表現(xiàn)出強(qiáng)烈而持久的改變，而該指標(biāo)對于臨床上人體氟化物中毒引起的腎近曲小管損傷的早期檢測和長期觀察具有重要意義。

科研應(yīng)用：模型有助于制定用于治療人氟中毒致腎衰竭的指導(dǎo)方針，用于模擬臨床上的氟中毒患者。萬曉軍應(yīng)用此模型研究了TGF-β1和AQP2在氟中毒大鼠的表達(dá)及意義[39]。 也可通過本模型研究不同劑量氟對大鼠骨代謝及肝、腦、腎損傷的影響[40]。

(7)順鉑誘導(dǎo)

模型評價(jià)：順鉑(CP)在臨床應(yīng)用中對人體存在一定的毒性，尤其是對腎具有較大的毒性。鏡下可見腎髓質(zhì)外側(cè)大部分腎小管壞死，小管上皮細(xì)胞壞死，脫落，細(xì)胞核故所，溶解，消失，小管管腔擴(kuò)張，腔內(nèi)有脫落碎屑。優(yōu)點(diǎn)是模型制作方法簡便，可行性高。

科研應(yīng)用：可用于探索順鉑類藥物的作用機(jī)制，藥物代謝，研究相關(guān)防治措施。Menon等研究發(fā)現(xiàn)兩種阿育吠陀制劑，來緩解順鉑誘發(fā)的急性腎衰竭[41]。也可用于研究促紅素預(yù)防順鉑所致的大鼠急性腎功能衰竭的腎保護(hù)作用[42]。

3 總結(jié)與展望

在疾病的模型研究中，不同模型可以用于滿足不同的研究需求。在實(shí)驗(yàn)初期階段，應(yīng)明確研究目的，結(jié)合適用性和實(shí)用性選取更適合的模型來達(dá)到更好的效果，本文對模型的選取提供了一定的指導(dǎo)。我國作為腎病大國，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基石，研究不同類型腎病的發(fā)生機(jī)制，不僅為腎病藥物的研發(fā)和治療方法的開創(chuàng)奠定了基礎(chǔ)，也為未來攻克腎病難題點(diǎn)亮了一盞希望之燈。相信在未來的工作中，一定會(huì)研究出更適合的腎衰模型。