舒麗霞，羅朋立

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，青海 西寧 810001)

腎病綜合征(nephrotic syndrome，NS)是以大量蛋白尿?yàn)樘卣鞯囊唤M疾病。蛋白尿的產(chǎn)生與腎小球?yàn)V過膜的三層結(jié)構(gòu)(內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、足細(xì)胞)密切相關(guān)。近年來有學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞表面有一層蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物(也叫糖萼，Glycocalyx，GCX)，其與尿蛋白的產(chǎn)生密切相關(guān)[1]。GCX是血管內(nèi)皮表面的一層蛋白質(zhì)多糖復(fù)合物，其核心分子是蛋白多糖和糖蛋白(主要包括syndecans、glypicans等)；由核心蛋白通過O-糖基鍵與無支鏈糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)側(cè)鏈相連接；NS時(shí)GCX層結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，加之血漿TNF-α水平升高使內(nèi)皮GCX孔徑增加，致出現(xiàn)大量蛋白尿和嚴(yán)重的低白蛋白血癥[2]；由于白蛋白有助于GCX的修復(fù)，NS時(shí)大量的蛋白尿?qū)е卵獫{白蛋白的流失，加重了腎小球內(nèi)皮GCX的損傷[3]。GAG中含量最多的是硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)，超過體積的50%，還有透明質(zhì)烷(Hyaluronan，HA)、硫酸皮膚素(Dermatan sulfate，DS)[4]。主要的功能GAG是HS，HS作為電荷屏障阻止血液中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從尿液中損失，而乙酰肝素酶(Heparanase，HPSE)能在特定的位點(diǎn)切割HS鏈內(nèi)的糖苷鍵，從而斷開硫酸乙酰肝素-糖蛋白(Heparin sulfate proteoglycans，HSPG)的鏈接[5]。HPSE在實(shí)驗(yàn)性腎小球疾病如阿霉素腎病、嘌呤毒素腎病及其他腎小球疾病等導(dǎo)致蛋白尿的疾病中表達(dá)上調(diào)，并伴隨著HS的減少[5-7]。另外，多種炎性因子參與NS的發(fā)病，如腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等參與細(xì)胞免疫和體液免疫，介導(dǎo)腎臟損傷[8-9]，可直接損傷腎小球和足細(xì)胞，導(dǎo)致大量蛋白尿[10-11]。

NS患者全身血管系統(tǒng)處于高凝狀態(tài)；NS的治療藥物如皮質(zhì)固醇類激素、利尿劑等可加重NS患者的高凝狀態(tài)?？鼓委熓荖S的一個(gè)重要輔助治療手段，LMWH因具有生物利用度高、副作用少等特點(diǎn)在臨床上被廣泛應(yīng)用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)LMWH在多種疾病中通過非抗凝機(jī)制發(fā)揮臟器保護(hù)作用，包括對(duì)腎臟功能的保護(hù)。

本研究擬觀察LMWH對(duì)原發(fā)性腎病模型大鼠的治療作用及其對(duì)腎臟GCX，血漿TNF-α、IL-6的影響，探討其對(duì)阿霉素NS大鼠的治療作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，8周齡，體重(200±20)g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2017-003；適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：12小時(shí)明暗交替。

1.1.2 主要試劑及儀器

鹽酸阿霉素(北京索萊寶科技有限公司；貨號(hào)：D8740，25mg/支)；LMWH(齊魯制藥有限公司；國藥準(zhǔn)字：H20030428，0.2mL/2500IU)。兔抗大鼠Syndecan-1一抗[abcam；貨號(hào)：ab128936，100μL(1.123mg/mL)]；兔抗大鼠Glypican-1一抗[abcam；貨號(hào)：ab106003，100μg(2.1mg/mL)]；α-Tublin、山羊抗兔二抗(索萊寶公司)；RIPA蛋白裂解液(索萊寶公司)。白蛋白檢測(cè)試劑盒(南京建成公司；貨號(hào)：A028-2；96T)；BCA蛋白定量試劑盒(賽默飛公司)；2×蛋白上樣緩沖液(索萊寶公司)；ELISA試劑盒(TNF-α、IL-6、HS、HPSE、Syndecan-1均購自武漢華美生物工程有限公司)；總膽固醇(T-CHO)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A111-1；96T)。電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio Rad公司)；酶標(biāo)儀(Bio Rad公司；MPM6)；KD-BMⅡ電腦生物組織包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；大鼠代謝籠(江蘇塞昂斯生物科技)。

1.1.3 NS模型

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，參照文獻(xiàn)[12]造模。注射阿霉素3周后用代謝籠收集24小時(shí)尿液，收集尿液期間禁食，自由飲水；造模成功后于皮下注射LMWH。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理

6只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，24只經(jīng)尾靜脈注射阿霉素(共6.0mg/kg)制備NS模型設(shè)為模型組和治療組。注射阿霉素20天后用代謝籠收集大鼠24小時(shí)尿液，記錄尿量并檢測(cè)尿蛋白含量，24小時(shí)尿蛋白大于等于200 mg的大鼠視為造模成功[12]，最后大鼠被分為正常對(duì)照組(6只)，模型組(6只)，LMWH治療5、7、9天組(其中兩組各有1只造模不成功，另一組有一只大鼠產(chǎn)生大量腹水并死亡)；正常對(duì)照組和模型組經(jīng)皮下注射生理鹽水(0.1mL/d/只)，各LMWH治療組經(jīng)皮下每天注射LMWH(200IU/只)，分別在給藥后的第5、7、9天收集24小時(shí)尿液，檢測(cè)尿蛋白含量。

1.2.2 標(biāo)本收集

給藥后第5、7、9天分別收集各LMWH治療組大鼠24小時(shí)尿液離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，去除沉渣后置冰箱(-20℃)保存待測(cè)；用3%的戊巴比妥鈉(0.15mL/kg)于腹腔注射麻醉大鼠，從腎靜脈采血離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，取上清液置冰箱(-20℃)保存待測(cè)。采血后結(jié)扎腎蒂，摘取腎臟組織置冰箱(-80℃)保存待行WB檢測(cè)，另取腎臟組織浸泡于4%多聚甲醛固定后行HE染色。最后再收集正常對(duì)照組及模型組大鼠24小時(shí)尿液及大鼠血漿和腎臟組織。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)

用試劑盒分別檢測(cè)血漿白蛋白含量及尿蛋白含量；血漿HS、HPSE、Syndecan-1、TNF-α、IL-6含量；血總膽固醇。

1.2.4 HE染色

先將浸泡在4%多聚甲醛里的腎皮質(zhì)包埋(在KD-BMⅡ電腦生物組織包埋機(jī)中進(jìn)行)，包埋后切片(5μm)，按照預(yù)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行梯度酒精浸泡后染色、脫色、鏡下觀察。

1.2.5 WB檢測(cè)

提取組織蛋白后，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，按SDS-PAGE凝膠試劑盒說明配置10%的分離膠及5%濃縮膠，上樣前加入2×蛋白上樣緩沖液，每孔上樣30 μg后開始以80 V電泳15分鐘，再切換至120 V約80分鐘，待蛋白樣本達(dá)到分離膠的底部時(shí)，停止電泳。用激活的PVDF膜覆蓋后用恒定電流(200mA)轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，取出PVDF膜，浸泡于脫脂牛奶中封閉(室溫)1小時(shí)后置封口袋封閉孵育(4℃冰箱內(nèi)過夜)相應(yīng)一抗，用1×TBST液清洗7次(7min/次)。室溫下孵育相應(yīng)二抗1小時(shí)，洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LMWH對(duì)NS大鼠蛋白尿的影響(表1)

與NS模型組比較，各LMWH治療組大鼠24小時(shí)尿蛋白含量均有所降低，給藥7天開始差異具有顯著性，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各給藥組間尿蛋白含量差異不明顯。

2.2 LMWH對(duì)NS大鼠血漿總膽固醇及血漿蛋白含量的影響(表2)

與正常對(duì)照組相比，NS模型組血漿總膽固醇(Total Cholesterol；TC)含量明顯增加，在給藥后第9天血總膽固醇含量明顯減少(P<0.05)；與正常對(duì)照組比較，模型組血漿白蛋白顯著減少，LMWH治療7天組出現(xiàn)血漿白蛋白水平升高(P<0.05)。

2.3 LMWH對(duì)NS大鼠血漿GCX的影響(表3)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血漿Syndecan-1、HS含量較高；經(jīng)LMWH治療后血漿HS含量明顯下降，Sydecan-1含量升高，治療9天開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)(P>0.05)；HPSE含量較模型組增加(P<0.05)。

2.4 LMWH對(duì)NS大鼠腎皮質(zhì)GCX核心蛋白Syndecan-1和Glypican-1含量的影響(表4，圖1)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠Glypican-1、Syndecan-1含量顯著減少(P<0.05)；與模型組比較，各治療組腎小球內(nèi)皮Glypican-1、Syndecan-1含量增加。

Table 1Effect of LMWH on urinary protein in rats with

#：與模型組比較，P<0.05；*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

Table 2Effect of LMWH on plasma TC and albumin levels in NS

#：與模型組比較，P<0.05；*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

Table 3Effect of LMWH on plasma HS，HPSE and Syndecan-1，contents in NS

#：與模型組比較，P<0.05；*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

Table 4Result of Glypican-1 and Syndecan-1 contents in kidney of NS rats by

#：與模型組比較，P<0.05；*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

1：正常對(duì)照組 2：模型組 3：LMWH5天組 4：LMWH7天組 5：LMWH9天組

2.5 LMWH對(duì)NS大鼠血漿TNF-α和IL-6的影響(表5)

與正常對(duì)照組比較，腎病模型組大鼠血漿TNF-α、IL-6含量明顯增加(P<0.05)；經(jīng)LMWH治療后兩者有下降趨勢(shì)，TNF-α在治療9天時(shí)血漿水平較腎病模型組明顯減少(P<0.05)，血漿IL-6含量在給藥7天后明顯降低(P<0.05)。

Table 5The effect of LMWH on plasma TNF- α and IL-6 in NS

#：與模型組比較，P<0.05；*：與正常對(duì)照組比較，P<0.05

2.6 腎組織HE染色(圖2)

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織可見腎小球上皮細(xì)胞腫脹擴(kuò)大，腎小球間質(zhì)可見均質(zhì)紅染物質(zhì)增多，少量單核細(xì)胞滲出，個(gè)別囊腔內(nèi)見少量紅細(xì)胞漏出，腎小管上皮細(xì)胞胞漿疏松化、體積增大，管腔內(nèi)有大量透明管型，未見新月體、壞死及硬化；與模型組比較，各LMWH治療組腎小球上皮細(xì)胞水腫程度減輕，腎小管內(nèi)透明管型明顯減少，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)疏松化程度減輕。

對(duì)照組 模型組

低肝5天組 低肝7天組 低肝9天組

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用阿霉素誘導(dǎo)NS模型，其臨床表現(xiàn)近似于原發(fā)性NS，是公認(rèn)的能夠較好地模擬人類腎病的模型[13]。LMWH治療后各組24小時(shí)尿蛋白含量較模型組明顯減少，血漿白蛋白含量升高，血漿TC、HS、TNF-α、IL-6含量顯著減少，HE染色結(jié)果顯示治療后腎小管內(nèi)透明管型明顯減少，提示LMWH是有效治療NS的手段。

在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)LMWH治療9天后血漿白蛋白含量得到回升，同時(shí)伴隨著24小時(shí)尿蛋白、血漿TNF-α及IL-6、HS、TC含量顯著減少。與田建梅[14]等用LMWH聯(lián)合潑尼松作用于NS患兒，治療一個(gè)月后患兒血漿總膽固醇、24小時(shí)尿蛋白含量明顯下降的結(jié)果一致。LMWH因具有與HS相似的結(jié)構(gòu)，可修復(fù)腎小球內(nèi)皮GCX結(jié)構(gòu)、降低腎小球?yàn)V過膜通透性，從而降低NS蛋白尿含量并提升血漿白蛋白水平[15]，對(duì)腎臟發(fā)揮保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LMWH治療后大鼠血漿GCX(HS、Syndecan-1)含量較模型組減少，HPSE含量增加(P<0.05)。組織GCX(Glypican-1、Syndecan-1)含量增加(P>0.05)，可能與LMWH的血藥濃度有關(guān)，因?yàn)長MWH以劑量依賴性方式防止GCX核心蛋白脫落，起到保護(hù)作用[2]，提示LMWH有修復(fù)GCX的作用。GCX得到修復(fù)后導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生減少，進(jìn)而血漿白蛋白含量回升，而血漿白蛋白升高抑制了血漿TC的升高。

經(jīng)LMWH治療后大鼠血漿TNF-α、IL-6水平明顯降低，可能與LMWH的抗炎作用有關(guān)。LMWH抗炎作用機(jī)制可能從抗凝機(jī)制和非抗凝機(jī)制兩方面體現(xiàn)：抗凝機(jī)制主要是通過抑制FXa而發(fā)揮抗炎作用，凝血因子FXa是一類能促進(jìn)炎癥反應(yīng)的酶，可通過G蛋白偶聯(lián)受體-3激活炎癥細(xì)胞；還可與內(nèi)皮細(xì)胞及白細(xì)胞上存在的一個(gè)特異性FXa受體-效應(yīng)器蛋白酶受體-1(effector protease receptor-1，ERP1)結(jié)合，促進(jìn)炎癥介質(zhì)如IL8、IL6、TNF-α等釋放[16]；LMWH的非抗凝抗炎機(jī)制主要是通過抑制炎癥細(xì)胞、炎癥因子(如TNF-α、白介素等)及黏附分子等發(fā)揮抗炎作用；通過降低體內(nèi)炎癥因子水平達(dá)到抗炎作用[16-18]。有研究顯示血漿TNF-α、IL-6水平增加也可促進(jìn)GCX的脫落，加重蛋白尿癥狀[19]，因此抑制二者表達(dá)可能也是LMWH發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述，LMWH可能是通過修復(fù)GCX減少蛋白尿的產(chǎn)生[1]，并通過降低血漿TNF-α、IL-6含量減少蛋白尿的產(chǎn)生[20]。這可能是LMWH保護(hù)阿霉素NS大鼠腎臟的重要機(jī)制之一。