鐘 勇，柴克霞

(1.青海大學(xué)，810016；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，810001)

多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)和皮肌炎(dermatomyositis，DM)是特發(fā)性炎性肌病最常見的兩種亞型，目前發(fā)病機制尚不明確，研究認(rèn)為可能與血管新生、炎癥反應(yīng)、自噬等相關(guān)。自噬及其相關(guān)蛋白在參與調(diào)控免疫應(yīng)答和控制過度炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。微管輕鏈I蛋白3-II型(microtubule-associated protein light chain，LC3-Ⅱ)是表達于自噬小體的特異性分子標(biāo)志，在自噬晚期階段表達，能夠反映自噬的表達水平[2]。自噬具有多條調(diào)節(jié)通路，其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)與真核細胞的自噬、增殖和凋亡等多個過程相關(guān)，參與了多條自噬調(diào)節(jié)通路并且可抑制自噬。研究表明[3]，低氧可以誘導(dǎo)自噬，同時參與了PM和DM的發(fā)病過程[4]，低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia induced factor-1α，HIF-1α)的過表達可使LC3-I向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化[5]，促進自噬的產(chǎn)生，其在PM和DM中是否也能誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生，尚未明確。本研究應(yīng)用免疫組化法檢測PM/DM患者肌肉組織中LC3-Ⅱ、mTOR和HIF-1α的表達水平，并且結(jié)合MDAAT+VAS評分[6]對疾病活動度進行評估，研究探討自噬相關(guān)蛋白mTOR、LC3-Ⅱ及HIF-1α在PM/DM發(fā)病中的作用及意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

選取青海大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2014～2017年的PM/DM初治患者作研究對象。PM組：男2例，女8例，年齡19～53歲，平均年齡44.5±10.7歲；DM組：男4例，女6例，年齡22～63歲，平均年齡40.3±11.2歲。Control(對照)組：選取2015年青海大學(xué)附屬醫(yī)院單純骨科創(chuàng)傷患者20例，其中男5例，女15例，年齡17～72歲，平均年齡53.4±18.9歲。各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)：PM/DM診斷標(biāo)準(zhǔn)采用Bohan和Peter于1975年制定的PM/DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2 標(biāo)本的采集及處理

PM及DM組選取肱三頭肌受累最重處的肌肉組織行肌肉活檢。Control組肌肉組織選取單純骨科創(chuàng)傷部位旁的正常肌肉組織。所有標(biāo)本用10%的福爾馬林溶液固定、石蠟包埋后制片行免疫組織化學(xué)染色。

1.3 LC3-Ⅱ、mTOR、HIF-1α水平的測定

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個樣本的均數(shù)比較采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間HIF-1α、LC3-Ⅱ、mTOR的表達

PM組和DM組mTOR的陽性表達均低于Control組(P<0.05)，PM組和DM組之間比較mTOR，它們的陽性表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PM組和DM組LC3-Ⅱ的陽性表達水平均高于Control組(P<0.05)，PM組和DM組之間比較LC3-Ⅱ，它們的陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DM組HIF-1α的陽性表達水平高于Control組和PM組(P<0.05)，PM組和Control組之間比較HIF-1α的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳細數(shù)據(jù)見表1。

2.2 MDAAT+VAS評分

DM組MDAAT+VAS評分為7.20±2.66分；PM組為6.40±2.07分。

2.3 相關(guān)性分析

PM組和DM組中的mTOR與LC3-Ⅱ的平均光密度值均呈負相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為-0.739、-0.740，P<0.05)，見圖1、2；PM組和DM組中LC3-Ⅱ平均光密度值與MDAAT+VAS評分呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.848、0.811，P<0.05)，見圖3、4；PM組和DM組中mTOR平均光密度值與MDAAT+VAS評分無明顯相關(guān)性(P>0.05)。PM組和DM組中HIF-1α與LC3-Ⅱ、mTOR的平均光密度值及MDAAT+VAS評分均無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

Table 1The average optical density of mTOR，LC3-Ⅱ and HIF-1α in each

*：與Control組比較，P<0.05

圖1 PM組LC3-II與mTOR的相關(guān)分析圖

圖2 DM組LC3-II與mTOR的相關(guān)分析圖

圖3 PM組LC3-II與MDAAT+VAS評分的相關(guān)分析圖

圖4 DM組LC3-II與MDAAT+VAS評分的相關(guān)分析圖

3 討論

PM/DM的發(fā)病機制復(fù)雜，有研究認(rèn)為其主要類型機制有免疫和非免疫兩種。非免疫機制包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、自噬和凋亡等[4]。mTOR是一種進化保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶?？烧隙喾N細胞外信號，如缺氧、應(yīng)激等[9，10]。本研究結(jié)果顯示，mTOR在PM組和DM組中的表達均低于Control組，提示mTOR參與了PM/DM的發(fā)病過程。Souvik Kar[11]等研究表明血管內(nèi)皮生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以與細胞膜上的受體結(jié)合，負調(diào)控PI3K/AKT信號通路，該通路是mTOR的主要調(diào)節(jié)通路，可以上調(diào)mTOR的表達[12]，而VEGF在PM/DM中表達增強[13]。因此我們認(rèn)為，通過VEGF負調(diào)控mTOR的表達，mTOR在PM/DM的表達減少。另外，有研究認(rèn)為[14]PM/DM存在缺氧情況，在缺氧條件下，ATP生成減少，ATP/AMP比值降低，AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)被激活，mTOR表達被抑制，PM/DM中的mTOR表達下調(diào)也可能由缺氧引起。mTOR是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠調(diào)控基因、促進血管新生[15]；另外自噬參與了PM/DM的發(fā)病[16]，其具體的參與機制尚不明確。mTOR作為自噬啟動的上游關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可以通過磷酸化ATG13和ULK1，使ULK1-ATG13-FIP200復(fù)合物形成受阻，從而負調(diào)控自噬[12]。由于PM/DM中mTOR的表達受到抑制，其對自噬的抑制作用減弱，自噬反應(yīng)在PM/DM中增強。mTOR可能通過調(diào)節(jié)血管新生和自噬參與PM/DM的發(fā)病過程。

LC3-Ⅱ是自噬的標(biāo)志性蛋白，結(jié)合在自噬小體膜上，參與自噬的延伸過程，能夠間接反映自噬水平[2]，常作為反映自噬強度的指標(biāo)[17]。本研究結(jié)果顯示，LC3-Ⅱ在PM/DM組的表達水平均高于Control組，說明LC3-Ⅱ參與了PM/DM的發(fā)病過程。bcl-2可以與Beclin-1結(jié)合，下調(diào)Beclin-1依賴的自噬水平[18]。且PM/DM存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制[4]，當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，bcl-2結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其對自噬的對抗作用受到抑制，自噬增強[19]，LC3-Ⅱ表達上調(diào)。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能上調(diào)PM/DM中自噬的水平，進而使得LC3-Ⅱ的表達增強。研究還證實主要組織相容性復(fù)合體1(major histocompatibility complex class I，MHC-1)在PM/DM中表達增強[20]，可以促進細胞自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[21]，MHC-1通過上調(diào)自噬增強LC3-Ⅱ在PM/DM中的表達。由此我們認(rèn)為，上述兩種機制可使LC3-Ⅱ的表達在PM/DM中增強。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強子—α甘露糖苷酶樣蛋白1(ER degradation-enhancing alpha mannosidase-like protein，EDEM1)在細胞質(zhì)中被自噬降解，進而由EDEM1所致的對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的降解作用減弱[4]。因此，自噬也可以反過來通過促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，參與PM/DM的發(fā)病過程。

PM組和DM組中LC3-Ⅱ的表達與mTOR的表達呈負相關(guān)，mTOR可能通過負調(diào)控自噬，參與了PM/DM中LC3的上調(diào)；本研究結(jié)果還顯示LC3-Ⅱ的表達水平與MDAAT+VAS評分呈正相關(guān)，提示LC3-Ⅱ的表達水平可能與疾病活動度有關(guān)：隨著疾病活動度增強，LC3-Ⅱ的表達也增強。

HIF-1α作為一種低氧誘導(dǎo)因子，參與腫瘤、血管新生、自噬[22-24]等多個病理生理過程。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α在DM組中的表達高于PM組和Control組。低氧環(huán)境下，HIF-1α的降解被抑制，表達增強。有研究認(rèn)為[14]PM/DM肌肉組織中存在缺氧機制，因此，DM肌肉組織的缺氧導(dǎo)致了HIF-1α的表達上調(diào)。VEGF是HIF-1α的一個靶基因，HIF-1α能夠上調(diào)VEGF的表達，促進血管新生[22]。有研究顯示VEGF在PM/DM中表達增強，且在DM中的表達高于PM組[13]，這與本研究結(jié)果相符。HIF-1α通過上調(diào)VEGF的表達，促進DM肌肉組織中血管新生，參與DM的發(fā)病過程；HIF-1α還可以負調(diào)控凋亡抑制因子bcl-2的表達，促進細胞凋亡，HIF-1α可能通過該機制參與DM的發(fā)病過程。

綜上所述，自噬相關(guān)蛋白mTOR及LC3-Ⅱ參與了PM和DM的發(fā)病過程，HIF-1α參與了DM的發(fā)病過程，且LC3-Ⅱ與疾病的活動度相關(guān)。但因樣本數(shù)有限，加之自噬的調(diào)節(jié)與許多因素相關(guān)，故本研究結(jié)論有待進一步驗證。