王 紅，韓曉萍

(1.青海省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，青海 西寧 810000；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 青海 西寧 810000)

藏藥經(jīng)典方劑二十五味珍珠丸組方收載于藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》，其處方由珍珠、西紅花、牛黃、麝香等二十七味藏藥組成。為更好地掌握本品種中牛黃、西紅花兩種藥味的整體存在情況，本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其余組分檢測(cè)分析的文獻(xiàn)研究[1-5 ]基礎(chǔ)上，對(duì)處方中的牛黃、西紅花進(jìn)行了多組分多通道特征圖譜研究，建立了二十五味珍珠丸的雙通道(HPLC-TUV-ELSD)特征圖譜。

1 材料與方法

1.1 材料

多通道串聯(lián)高效液相色譜儀Waters 2695- 2489紫外檢測(cè)器(TUV通道)-2424蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD通道)購(gòu)自美國(guó)沃特世公司；百萬(wàn)分之一電子天平梅特勒XS105DU購(gòu)自瑞士梅特勒公司；萬(wàn)分之一賽多利斯CPA 225D電子天平購(gòu)自德國(guó)賽多利斯公司；必能信KQ5200超聲波清洗器購(gòu)自美國(guó)艾默生公司。

二十五味珍珠丸(編號(hào)A～E)，購(gòu)自青海及西藏的2家生產(chǎn)企業(yè)及3家醫(yī)院制劑室，共計(jì)5個(gè)品牌；原料藥材購(gòu)自青海金訶藏藥股份有限公司。

膽酸(批號(hào)：110178-200814)、去氧膽酸(批號(hào)：110734-200907)、豬去氧膽酸(批號(hào)：100187-201410)、西紅花苷-Ⅰ(批號(hào)：111588-201401)、西紅花苷-Ⅱ(批號(hào)：111589-201402)、牛黃膽酸鈉對(duì)照品(批號(hào)：110815-201406)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件選擇

采用agilent 杜邦系列中的SB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)。流動(dòng)相組成為乙腈A及1%甲酸B，按程序進(jìn)行梯度洗脫，具體為0～60 min范圍內(nèi)流動(dòng)相A自18%→40%，流速1 mL·min-1，柱溫35 ℃，TUV檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm。ELSD檢測(cè)器參數(shù)設(shè)置：漂移管加熱溫度85 ℃，霧化氣噴霧壓力為32 psi，增益為95。理論塔板數(shù)按西紅花苷-I色譜峰計(jì)，應(yīng)高于8000[6-7]。

1.2.2 測(cè)試溶液制備

1.2.2.1 供試品溶液制備

取樣品5粒，研細(xì)，稱取2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，超聲處理40 min(功率250W，頻率40kHz，加冰塊)，取出，至室溫時(shí)稱定重量，用甲醇補(bǔ)重，濾過，取續(xù)濾液。

1.2.2.2 參照溶液制備

精密稱取西紅花苷-Ⅰ、Ⅱ?qū)φ掌犯?0 mg，加甲醇制成每1 mL各約含 80 μg的混合溶液(TUV通道參照溶液)；另精密稱取?；悄懰徕c、膽酸、豬去氧膽酸及去氧膽酸四種對(duì)照品約25 mg，加甲醇制成每1 mL各約含0.1 mg的溶液(ELSD通道參照溶液)。其中分別以西紅花苷-Ⅰ和膽酸作為各自通道的相應(yīng)參照S峰[8]。

1.2.3 測(cè)定

分別精密吸取上述供試品溶液10 μL、兩種西紅花苷類混合對(duì)照品5 μL、四種膽酸類混合對(duì)照品10 μL，注入液相色譜儀分析測(cè)定，記錄色譜圖。

1.2.4 雙通道特征圖譜建立

通過與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜的雙重比對(duì)，對(duì)二十五味珍珠丸樣品中的色譜峰進(jìn)行歸屬和定位。建立的二十五味珍珠丸對(duì)照特征圖譜見圖1，圖1顯示，共有峰有15個(gè)，較為全面地反映了處方中兩味藥材信息。其中TUV440 nm通道主要考察方中西紅花化學(xué)成分，ELSD通道考察方中牛黃化學(xué)成分[9]。

峰1(S)：西紅花苷-Ⅰ；峰2：西紅花苷-Ⅱ；峰8：牛黃膽酸鈉；峰11(S)：膽酸；峰12：豬去氧膽酸；峰15：去氧膽酸

圖1二十五味珍珠丸多通道特征圖譜

Figure1Multi-channelcharacteristicsofchromatogramof25PearlPills

圖1示，二十五味珍珠丸TUV色譜圖中共確認(rèn)出7個(gè)特征峰，峰1、2與西紅花苷-Ⅰ、Ⅱ的保留時(shí)間相同，以峰1為S峰，計(jì)算其余6個(gè)峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，分別為1.000(峰1)、1.318(峰2)、2.175(峰3)、2.388(峰4)、2.572(峰5)、2.960(峰6)、3.027(峰7)；ELSD色譜圖中共確認(rèn)出8個(gè)特征峰，其中峰8、11、12、15分別與?；悄懰徕c、膽酸、豬去氧膽酸、去氧膽酸保留時(shí)間相同，以其中峰面積相對(duì)較高的峰10作為S峰，計(jì)算其余7個(gè)峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，分別為0.585(峰8)、0.614(峰9)、0.726(峰10)、1.000(峰11)、1.081(峰12)、1.163(峰13)、1.208(峰14)、1.390(峰15)。其中峰1(S)為西紅花苷-Ⅰ、峰2為西紅花苷-Ⅱ、峰8為牛黃膽酸鈉、峰11(S)為膽酸、峰12為豬去氧膽酸、峰15為去氧膽酸。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 精密度考察

精密吸取1.2.2.1項(xiàng)下制備的二十五珍珠丸(20141120)供試品溶液10 μL，按1.2.1項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)定TUV440 nm及ELSD通道下各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，結(jié)果均<3.0%，表明儀器精密度良好。

1.2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取二十五珍珠丸(20141120)同一樣品6份，按照1.2.2.1項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，在1.2.1項(xiàng)的色譜條件下分別測(cè)定其在440 nm及ELSD通道下的供試品溶液的特征圖譜，計(jì)算上述各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果均<3.0%，說明本方法重復(fù)性較好。

1.2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取二十五珍珠丸(20141120)樣品，按1.2.2.1項(xiàng)下的要求制備成供試品溶液，分別于配制后的0、4、8、12、16、24 h進(jìn)行進(jìn)樣分析測(cè)定，測(cè)定兩品種在440 nm及ELSD通道下特征圖譜中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD，結(jié)果均<3.0%，說明按本法制備的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果及分析

按上述建立好的特征圖譜測(cè)定的方法對(duì)收集的全部樣品進(jìn)行分析測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2010年版軟件進(jìn)行結(jié)果計(jì)算及評(píng)價(jià)，以考察兩品種的工藝穩(wěn)定性和樣品均一性，結(jié)果分析如下：

2.1 同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次二十五味珍珠丸多通道特征圖譜比較結(jié)果及分析

對(duì)樣品收集量大于三批次的企業(yè)產(chǎn)品見表3，進(jìn)行特征圖譜相似度分析，以各企業(yè)的平均特征圖譜作為參照譜進(jìn)行相似度對(duì)比分析(樣本量大于3批次)，代表圖譜見圖2，相似度結(jié)果見表1。

圖2同一生產(chǎn)企業(yè)二十五味珍珠丸多通道特征圖譜比較圖

Figure2Comparisonofcharacteristicsofchromatogramfromthesamemanufactory

表1同一生產(chǎn)企業(yè)特征圖譜相似度比較結(jié)果

Table 1Comparison of similarity from the same manufactory

同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次樣品之間的相似度結(jié)果分析表明，企業(yè)批間產(chǎn)品的相似度總體較好，說明同一生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)工藝和投料藥材質(zhì)量基本穩(wěn)定?？傮w表現(xiàn)為兩品種中TUV通道在整體企業(yè)間的相似度明顯高于ELSD通道，說明各企業(yè)生產(chǎn)投料用的西紅花藥材的質(zhì)量相對(duì)牛黃較穩(wěn)定，特征圖譜中共有峰的檢出情況相對(duì)較好。

在TUV通道中，企業(yè)B的二十五味珍珠丸批間相似度僅為0.714，此結(jié)果與其測(cè)定的6批次樣品中3批次的西紅花苷-Ⅱ指標(biāo)未檢出有關(guān)，其余企業(yè)產(chǎn)品的批間相似度均大于0.90；在ELSD通道中，雖然企業(yè)B的二十五味珍珠丸批間相似度均大于0.90，但結(jié)合含量測(cè)定的數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)其兩品種中均未檢出相應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)，在與自身企業(yè)的樣品平均圖譜做對(duì)照的情況下，反而表現(xiàn)為圖譜重復(fù)性較好，但實(shí)際為異常數(shù)據(jù)。其余企業(yè)產(chǎn)品批間相似度均在0.80～0.90之間。

2.2 不同生產(chǎn)企業(yè)二十五味珍珠丸多通道特征圖譜比較結(jié)果及分析

經(jīng)過對(duì)同處方量西紅花、人工牛黃、培植牛黃、牛黃對(duì)照藥材的圖譜比對(duì)，篩選出相對(duì)質(zhì)量較優(yōu)、圖譜特征豐富的樣品作為對(duì)照特征圖譜。

對(duì)全部企業(yè)樣品進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié)果見表2。

表2不同生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品相似度統(tǒng)計(jì)表

Table 2Statistics of similarity from different manufactory

與選定的平均對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，整體樣品的TUV通道相似度范圍為0.472～0.978，明顯高于ELSD通道的相似度，說明相對(duì)于牛黃而言，各生產(chǎn)企業(yè)所用西紅花質(zhì)量穩(wěn)定，投料規(guī)范。

結(jié)合牛黃中多指標(biāo)成分的含量測(cè)定結(jié)果[3]分析發(fā)現(xiàn)，在二十五味珍珠丸中的ELSD通道中，除企業(yè)A外，其余企業(yè)樣品中均未檢出4種膽酸及其鹽類，總體相似度偏低。企業(yè)A相似度相對(duì)較高，為0.621～0.959，企業(yè)D的樣品中僅檢出了牛黃膽酸鈉和膽酸，相似度范圍為0.321～0.543，E僅檢出了膽酸，相似度為0.40左右。

綜上所述，對(duì)二十五味珍珠丸中的西紅花和牛黃質(zhì)量均可通過本文所建立方法監(jiān)測(cè)。

3 討論

本研究在對(duì)二十五味珍珠丸進(jìn)行文獻(xiàn)研究及處方分析的基礎(chǔ)上，對(duì)處方中藥味西紅花、牛黃中多個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行了多通道特征圖譜研究及含量測(cè)定，所得成果可以有效檢測(cè)和評(píng)價(jià)該藥物的整體質(zhì)量。

本研究所獲成果的特點(diǎn)是：①選取了藥味西紅花、牛黃中所含的西紅花苷-Ⅰ、Ⅱ，牛磺膽酸鈉，膽酸，豬去氧膽酸，去氧膽酸共計(jì)6個(gè)組分作為測(cè)定指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了多通道多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定，能快速經(jīng)濟(jì)地對(duì)其進(jìn)行較為整體的質(zhì)量控制。②建立了能同時(shí)用于方中6個(gè)組分測(cè)定的HPLC-TUV-ELSD多通道含量測(cè)定方法。③建立了二十五味珍珠丸的HPLC-TUV-ELSD多通道特征圖譜，能用于該品種的整體質(zhì)量控制。