周嬋萍，張 普，周伶俐，李向陽(yáng)

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，浙江 溫州 325000)

流行病學(xué)研究證實(shí)，宮頸癌的發(fā)病率可達(dá)(273～478)/10萬(wàn)人[1]。臨床上宮頸癌的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊邿o(wú)瘤生存時(shí)間的下降，增加了患者的3年內(nèi)的病死風(fēng)險(xiǎn)[2]。在探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制的過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)不同生物蛋白水平的波動(dòng)，能夠通過(guò)影響癌細(xì)胞周期的調(diào)控或者癌細(xì)胞的基因突變，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。抑癌基因P16(P16INK4A)的表達(dá)，能夠通過(guò)提高G1/S期的細(xì)胞比例，進(jìn)而促進(jìn)宮頸柱狀上皮細(xì)胞的增生和異常分化過(guò)程[3]；轉(zhuǎn)移抑制基因(KISS-1)能夠通過(guò)影響到癌細(xì)胞的變形能力，降低癌細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而影響惡性腫瘤患者臨床病情的進(jìn)展[4]。部分研究者探討了P16INK4A或者KISS-1的表達(dá)與甲狀腺癌或者直腸癌的關(guān)系，認(rèn)為相關(guān)腫瘤指標(biāo)的異常表達(dá)能夠顯著促進(jìn)患者生存預(yù)后的惡化，并導(dǎo)致患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的上升[4-6]，但在宮頸癌患者中的研究探討不足。為了揭示P16INK4A、KISS-1的表達(dá)與宮頸癌的關(guān)系，從而為臨床上宮頸癌患者的病情評(píng)估提供參考，本次研究選取2017年1月至2018年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院保存的宮頸鱗癌組織102例，探討P16INK4A、KISS-1蛋白的表達(dá)及其與宮頸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年1月至2018年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院保存的宮頸鱗癌組織102例，患者年齡34～57歲，平均年齡45.20歲；同時(shí)選取正常宮頸組織60例作為對(duì)照，年齡31～59歲，平均年齡44.80歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理組織學(xué)確診；②宮頸癌術(shù)前未行放化療等治療；③患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他惡性腫瘤者；②臨床資料欠缺者。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

病理標(biāo)本采用石蠟進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟脫水后采用H2O2室溫下孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，8%的蛋白粉封閉液(商品名：BSA，購(gòu)自南京博奧生物科技公司)封閉2h，倒去封閉液后加入一抗[兔來(lái)源，濃度為1：(1 000～1 500)]，4℃冰箱過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入二抗[鼠來(lái)源，1：(400～500)]，室溫孵育20～30min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，加入辣根酶或堿性磷酸酶的標(biāo)記物，室溫孵育10min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5min，滴加顯色劑(DAB，購(gòu)自南京博奧生物科技公司)，復(fù)染，脫水，封片。

1.3結(jié)果判斷

P16INK4A定位于細(xì)胞核或胞質(zhì)，KISS-1定位于細(xì)胞質(zhì)，染色陽(yáng)性呈棕黃色顆粒。隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，對(duì)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例得分之和≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，P16INK4A與KISS-1表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組織P16INK4A、KISS-1陽(yáng)性表達(dá)率比較

宮頸鱗癌組織P16INK4A陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，KISS-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1各組織P16INK4A、KISS-1陽(yáng)性表達(dá)率比較[n(%)]

Table 1 Comparison of positive expression rates of P16INK4Aand KISS-1 between different tissues[n(%)]

組織例數(shù)(n)P16INK4A陽(yáng)性表達(dá)KISS-1陽(yáng)性表達(dá)正常宮頸組織60051(85.00)宮頸鱗癌10293(91.18)27(26.47)χ2128.44058.079P0.0000.000

A B C

注：A為正常宮頸組織KISS-1表達(dá)；B為宮頸鱗癌組織KISS-1表達(dá)；C為宮頸磷癌組織P16INK4A表達(dá)。

圖1部分組織免疫組化圖(×200)

Fig. 1 Immunohistochemical staining (×200)

2.2 P16INK4A及KISS-1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理關(guān)系

分化程度為中低分化的患者P16INK4A陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化者(P<0.05)；TNM分期Ⅰ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者KISS-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于TNM分期Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 P16INK4A、KISS-1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理關(guān)系[n(%)]

2.3相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示P16INK4A與KISS-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.518，P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 P16INK4A與KISS-1表達(dá)的相關(guān)性分析

Table 3 Correlation analysis of P16INK4Aand KISS-1

P16INK4A表達(dá) KISS-1表達(dá) 陽(yáng)性陰性rsP陽(yáng)性1875-0.5180.002陰性90

3討論

3.1 P16INK4A、KISS-1在宮頸癌患者中的相關(guān)背景研究

多次妊娠史或者宮腔操作史均能夠促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，特別是在合并有HPV16、HPV18感染的患者中，宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高，遠(yuǎn)期的臨床轉(zhuǎn)歸惡化更為明顯[7-10]。P16INK4A是蛋白激酶家族成員，主要表達(dá)在多向分化潛能的細(xì)胞或者部分正常的上皮細(xì)胞中，在惡性腫瘤或者慢性自身免疫性疾病患者中，P16INK4A的表達(dá)濃度可顯著上升。P16INK4A能夠通過(guò)對(duì)糖蛋白末端的磷酸化修飾作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞內(nèi)的G1/S期比例的異常，提高癌細(xì)胞快速跨越G0期的能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的持續(xù)性DNA分裂。P16INK4A的上升能夠?qū)е掳┘?xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移能力的上升，增加了腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)[11]；KISS-1是轉(zhuǎn)移調(diào)控因子，其能夠抑制癌細(xì)胞的偽足形成，降低上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換的能力，降低癌細(xì)胞浸潤(rùn)和突破基底膜組織的能力。有研究認(rèn)為，KISS-1的表達(dá)還能夠降低癌細(xì)胞金屬基質(zhì)成分分解的速度，降低癌細(xì)胞的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)[12-13]。

3.2 P16INK4A、KISS-1在宮頸癌患者中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

本次研究通過(guò)免疫組化研究了宮頸癌患者病灶組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者病灶組織中，P16INK4A蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯上升，而KISS-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率則明顯下降，提示了相關(guān)蛋白的異常表達(dá)均能夠促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。筆者認(rèn)為這主要由于P16INK4A或者KISS-1的下列幾個(gè)方面的作用有關(guān)：①P16INK4A的表達(dá)上升，能夠?qū)е聦m頸柱狀上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活程度的上升，提高了宮頸柱狀上皮細(xì)胞的核異常裂變的風(fēng)險(xiǎn)；②KISS-1表達(dá)濃度的下降，導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的顯著上升，增加了癌細(xì)胞對(duì)于臨近的宮旁組織的浸潤(rùn)過(guò)程[14]。徐雯等[15]研究也發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌患者病灶組織中，P16INK4A的表達(dá)陽(yáng)性率可平均上升25%以上，特別是在合并有明顯的宮旁組織浸潤(rùn)或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中，P16INK4A蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率上升更為明顯。免疫組化染色分析研究可見(jiàn)，P16INK4A或者KISS-1蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞異型性較為明顯的區(qū)域，提示了二者的表達(dá)可能還影響到癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。在探討P16INK4A或者KISS-1的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系過(guò)程中，可以發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞分化程度較差的患者中，P16INK4A蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率可顯著上升，而在臨床分期較晚或者發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，KISS-1蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率則顯著下降，提示了P16INK4A或者KISS-1的表達(dá)與宮頸癌患者的臨床病理特征密切相關(guān)，這主要是由于P16INK4A或者KISS-1的表達(dá)異常，能夠通過(guò)影響癌細(xì)胞的黏附浸潤(rùn)過(guò)程，導(dǎo)致癌細(xì)胞分化成熟能力和淋巴結(jié)黏附能力的改變，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌患者病情進(jìn)展。相關(guān)關(guān)系分析顯示，P16INK4A與KISS-1蛋白具有負(fù)性相關(guān)關(guān)系，推測(cè)其可能的內(nèi)在機(jī)制主要由于P16INK4A與KISS-1能夠通過(guò)影響癌細(xì)胞內(nèi)核因子Kappa B(nuclear factor Kappa B, NF-KB)信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)宮頸柱狀上皮細(xì)胞增殖速度的加快，增加了癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3小結(jié)

綜上所述，宮頸癌患者P16INK4A蛋白的表達(dá)明顯上升，而KISS-1的表達(dá)明顯下降，P16INK4A或者KISS-1的表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征密切相關(guān)，同時(shí)二者的表達(dá)具有一定的內(nèi)在相關(guān)關(guān)系。