李慧峰 黃詠梅 李彥青 滑金鋒 吳翠榮 范繼征 陳天淵

摘? 要? 基于簡化基因組測序技術(shù)對122份甘薯種質(zhì)資源進行分析，開發(fā)SNP位點并將其應用于種質(zhì)資源群體結(jié)構(gòu)和遺傳進化分析。結(jié)果表明， 從122份甘薯種質(zhì)資源中共獲得563.18 Mb讀長，不同材料的讀長數(shù)量在1 419 809～8 392 785范圍之間。測序質(zhì)量值Q30在90.61%～96.82%之間，平均Q30為92.78%。測序獲得的GC含量在36.46%～40.33%之間，平均GC含量為38.17%，對照GC含量為40.72%。根據(jù)測序結(jié)果共開發(fā)出高質(zhì)量的SLAF標簽2 388 759個，平均測序深度為17.45。其中，多態(tài)性的SLAF標簽77 761個，占SLAF標簽總數(shù)的3.26%。根據(jù)所獲得多態(tài)性SLAF標簽統(tǒng)計SNP位點信息，共計獲得129 063個群體SNP位點。遺傳進化分析表明122份種質(zhì)資源可以分為3個大類，分類結(jié)果與它們的地理來源無直接關(guān)系，聚類結(jié)果可為甘薯育種親本組配和雜種優(yōu)勢利用提供科學依據(jù)。

關(guān)鍵詞? 甘薯;種質(zhì)資源;SLAF-seq;遺傳進化分析

中圖分類號? S531? ? ?文獻標識碼? A

Phylogenetic Analysis of Sweetpotato Germplasm Resources Based on SLAF-seq Technology

LI Huifeng， HUANG Yongmei， LI Yanqing， HUA Jinfeng， WU Cuirong， FAN Jizheng， CHEN Tianyuan*

Maize Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract? Based on SLAF-seq technology， 122 sweet potato germplasm resources were used to develop SNP sites， which were applied to the analysis of population structure and genetic evolution on all germplasm resources. Results showed that 563.18 Mb reads length was obtained by sequencing， the reads of the samples varied from 1 419 809 to 8 392 785. The sequencing quality value （Q30） changed from 90.61% to 96.82%， and the average Q30 was 92.78%. The GC content of the samples changed from 36.46%40.33%， the average value was 38.17%， and that of the control was 40.72%. A total of 2 388 759 SLAF tags were developed， with an average sequencing depth of 17.45. There were 77 761 polymorphic SLAF tags accounting for 3.26% of the total SLAF tags. Finally， 129 063 SNPs were found. The population structure and genetic evolution analysis showed that 122 germplasm resources could be divided into three groups， which was not directly related to the geographical source， and the results of clustering could provide scientific basis for parents combination and utilization of heterosis in sweetpotato breeding.

Keywords? sweetpotato; germplasm resources; SLAF-seq; phylogenetic analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.011

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]既是我國保障糧食安全的底線作物，也是重要的保健食品、工業(yè)原料和新型能源作物，其種植面積、單產(chǎn)和總產(chǎn)均居世界前列[1-2]。但由于甘薯遺傳背景復雜，基因雜合度高，且具有自交不親和性等特點，給新品種選育工作帶來極大困難。同時，甘薯的品質(zhì)、產(chǎn)量和抗性等相關(guān)性狀多表現(xiàn)為數(shù)量遺傳，采用常規(guī)育種手段難以較快實現(xiàn)符合市場需求的育種目標，而分子標記輔助選擇技術(shù)為解決上述難點提供了新的路徑。目前甘薯中RAPD[3]、AFLP[4]、ISSR[5]、SSR[6-7]等標記的開發(fā)和利用已取得較大進展，但仍難滿足育種需求。特異性位點擴增片段測序技術(shù)（specific length amplification fragment sequencing，SLAF-seq）是基于第二代高通量測序技術(shù)發(fā)展而來，在開發(fā)大量特異分子標記方面具有通量高、準確性高、成本低、周期短的優(yōu)勢。該技術(shù)已應用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因組關(guān)聯(lián)分析、QTL定位和種質(zhì)資源鑒定等研究[8-9]。蘇文瑾等[10]首次將SLAF-seq技術(shù)應用于甘薯SNP位點的開發(fā)，共獲得795 794個SNP位點，表明其效率遠遠高于SSR、AFLP、RAPD等分子標記技術(shù)。石璇等[11]以8個甘薯品種或其近緣種為材料開發(fā)獲得了40 765個SNP位點，利用這些位點構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)甘薯栽培種和野生種I. trifida的親緣關(guān)系比較近。為弄清122份甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，本研究以這些種質(zhì)為實驗材料，通過SLAF-seq技術(shù)開發(fā)大量特異性SNP位點，并利用開發(fā)的位點分析材料之間的遺傳關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)，以期為甘薯新品種選育提供科學依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

根據(jù)前期工作基礎[12]，從廣西農(nóng)業(yè)科學院明陽基地甘薯種質(zhì)資源圃中選取表型差異較大的122份甘薯種質(zhì)資源作為研究材料，具體情況見表1。

1.2? 方法

1.2.1? DNA提取與質(zhì)量檢測? 2017年4月在甘薯種質(zhì)資源圃中采集每份資源的新展開頂葉，利用康維世紀新型植物基因組DNA提取試劑盒（NuClean Plant Genomic DNA Kit）提取DNA，分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀檢測濃度、純度和完整性，確保提取的DNA符合建庫要求。

1.2.2? 酶切建庫? 本研究開展前，未見甘薯或其近緣物種作為參考基因組的報道，故參照蘇文瑾等[10]的方法以馬鈴薯基因組作為參考基因組進行電子酶切預測，選定RsaⅠ為限制性內(nèi)切酶，通過酶切片段3′端加A處理，連接雙接頭后進行PCR擴增，選取目的片段回收建庫。

1.2.3? 建庫及產(chǎn)出數(shù)據(jù)質(zhì)量評估? 采用Illumina HiSeqTM2500對質(zhì)檢合格的文庫進行雙端測序，測序結(jié)束后通過去接頭、去低質(zhì)量閱讀框和去污染處理獲得干凈序列。同時設置水稻‘日本晴為對照，進行同流程操作，從比對效率、酶切效率和讀長插入片段分布情況來評估實驗建庫的準確性和有效性。最后通過計算GC含量和Q30評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.2.4? SLAF標簽分析與SNP鑒定? 依據(jù)Sun等[9]關(guān)于SLAF標簽和多態(tài)性SLAF標簽定義，根據(jù)序列相似性統(tǒng)計各類標簽的數(shù)量。同時，選取每個SLAF標簽中測序深度最高的序列為參考序列，利用BWA軟件[13]將測序讀長比對到參考序列上，使用GATK[14]和SAM tools[15] 2種方法開發(fā)SNP，選取2種方法共同獲得的SNP標記作為最終群體SNP標記。

1.2.5? 群體的遺傳進化分析? 根據(jù)獲得的最終SNP位點，利用Admixture軟件[16]分析種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)，并通過MEGA7軟件[17]構(gòu)建樣品的群體進化樹。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 基因組DNA的提取與檢測

DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，甘薯種質(zhì)資源DNA樣品主帶明顯，片段大小一致。

2.2? 建庫評估

根據(jù)馬鈴薯參考基因組電子酶切預測結(jié)果，選取RsaⅠ為限制性內(nèi)切酶，長度在264～364 bp的酶切片段為SLAF標簽，可預測到225 000個SLAF標簽。

實驗建庫評估主要根據(jù)對照水稻‘日本晴的比對效率、酶切效率和讀長插入片段分布情況進行判斷。從對照的測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果來看，其雙端比對效率為95.88%，酶切效率為100%，讀長插入片段分布在預期范圍之內(nèi)（圖2），表明本實驗建庫比對效率正常，SLAF建庫正常以及測序質(zhì)量正常。

2.3? 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與質(zhì)量評估

為保證分析質(zhì)量，本研究中均采用讀長100 bp× 2作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評估和分析數(shù)據(jù)，同時用對照水稻‘日本晴的測序數(shù)據(jù)評估本實驗庫的準確性。通過Illumina HiSeqTM2500測序平臺測序，從122個甘薯種質(zhì)資源中共獲得563.18 Mb讀長數(shù)據(jù)，不同種質(zhì)材料的讀長個數(shù)在1 419 809～

8 392 785范圍內(nèi)（圖3A）。不同材料的測序質(zhì)量值Q30在90.61%～96.82%之間，平均Q30為92.78%，對照的Q30為95.92%，表明測序堿基錯誤率低（圖3B）。同時，測序獲得的GC含量在36.46%～ 40.33%之間，平均GC含量為38.17%，對照GC含量為40.72%，則表明GC含量均較低符合測序要求（圖3B）。

2.4? SLAF標簽和SNP標記的開發(fā)與鑒定

根據(jù)122份甘薯種質(zhì)資源的測序結(jié)果，共開發(fā)出SLAF標簽238 8759個。不同甘薯種質(zhì)材料獲得的SLAF標簽數(shù)多少不一致，基本處于151 823～290 909之間（圖3C），各個材料的測序深度差異較大，其中不同種質(zhì)材料的測序總深度在1 071 660～6 833 246范圍之間，而每個材料的測序平均深度則在7.06%～24.93%之內(nèi)，平均測序深度為17.45。通過對所有SLAF標簽進行分型，最終獲得多態(tài)性的SLAF標簽77 761個，占SLAF標簽總數(shù)的3.26%。

此外，從多態(tài)性的SLAF標簽中獲得SNP標記22 4971個，每個材料獲得的SNP標記數(shù)目在61 887～163 937范圍內(nèi)，這些SNP的平均完整度在27.50%～72.87%之間，SNP的雜合度在19.49 % ～33.42 %之間（圖3D）。依據(jù)完整度大于50 %和次要基因型頻率（MAF）大于5%的選擇標準，對22 4971個群體SNP進行過濾，最終得到129 063個群體SNP位點。

2.5? 甘薯種質(zhì)資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳進化分析

利用篩選出的群體SNP位點對122份甘薯種質(zhì)資源進行群體結(jié)構(gòu)分析，通常根據(jù)交叉驗證錯誤率來確定分群數(shù)，擁有最低交叉驗證錯誤率的分群數(shù)為最優(yōu)分群數(shù)，如圖4A和圖4B所示，當K=3時交叉驗證錯誤率最低，進而說明所選擇的122份甘薯種質(zhì)資源群體可以分為3個類群。

從122份甘薯種質(zhì)資源的系統(tǒng)進化樹（圖4C）來看，所有資源根據(jù)遺傳關(guān)系可以分為3大類。其中，第Ⅰ大類包括29份資源，又可分為2個亞類，第Ⅰ-1類包括3份來自福建的資源泉薯830、配26、榕薯201和1份來自廣西的資源桂菜薯1號，第Ⅰ-2亞類則包括來自福建的新普六、福薯10號，來自廣西的思布黃皮薯、來賓丹心薯、楊圩薯2、欽南那麗5、烏邪爪、本地菜、紫葉薯、東皇薯1號、良圻薯2、紅皮薯、黃心白薯、永樂薯2、桂薯11號、桂薯2號、南洋1號、黃心薯，來自四川的綿薯7號，來自廣東的廣薯135、廣薯92-66、湛江薯、廣菜薯3號、普薯25、普薯24;第Ⅱ大類包括46份資源，第Ⅲ大類包括47份資源，這2個大類又可分為多個小類，但具體分類結(jié)果與甘薯種質(zhì)資源的地理來源無直接關(guān)系。

3? 討論

與傳統(tǒng)的分子標記相比，SNP標記是更加有效的遺傳標記，因為在大多數(shù)基因組中它們是最豐富和穩(wěn)定的遺傳變異形式[18]。對于無參考基因組的物種而言，簡化基因組測序技術(shù)因為能有效克服基因組復雜、序列與標記信息缺乏等難題，更適宜于SNP大規(guī)模的開發(fā)和分析。目前，已經(jīng)報道的簡化基因組測序技術(shù)主要有，限制性酶切位點相關(guān)的DNA（RAD）測序技術(shù)[19]，基于ⅡB型限制性內(nèi)切酶位點相關(guān)的DNA（Double Digest RAD-seq）測序技術(shù)[20]，基因分型測序（GBS）[21]，特異性長度擴增片段測序（SLAF-seq）技術(shù)，這些技術(shù)有一個共同點，即通過限制性內(nèi)切酶來降低基因組DNA的復雜程度。本研究運用SLAF-seq技術(shù)，從122份甘薯種質(zhì)資源中獲得563.18 Mb讀長數(shù)據(jù)，共開發(fā)出多態(tài)性的SLAF標簽77 761個，最終得到129 063個SNP位點用于遺傳進化分析。其中，SNP的平均完整度在27.50 %～72.87 %之間，SNP的雜合度在19.49 %～33.42 %之間。這與石璇等[11]研究結(jié)果有一定的差異，這可能與本研究中平均測序深度較高，獲得的SNP位點數(shù)量多有一定的關(guān)系。

利用SNP技術(shù)獲得的系統(tǒng)進化圖與育成品種的系譜作比較，發(fā)現(xiàn)部分育成品種之間有較好的吻合度。如桂粉3號和龍薯21優(yōu)先聚為一類，再與桂經(jīng)薯8號、廣薯205聚為一類，因為前兩者均以金山57為親本，而桂粉3號與桂經(jīng)薯8號、廣薯205則均以廣薯87為母本;綿薯6號、商薯19、徐紫薯3號和徐薯18聚為一類，因為綿薯6號的母本為徐薯18，徐紫薯3號的父本為徐薯18，而商薯19的父本中有一部分徐薯18的血緣;廣薯214和廣紫薯2號聚為一類，其中廣薯214的母本為廣紫薯2號;龍薯28與廣薯95-145聚為一類，兩者均含有同一個父本血緣;廣薯79、桂薯9號和普薯32號聚為一類，均含有廣薯69的血緣;廣薯42、桂薯5號、桂紫薇薯1號和廣薯87等聚為一類，這些品種均含有廣薯88-70的血緣。因此，利用SNP標記技術(shù)分析甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系有一定的可信度，其聚類結(jié)果與系譜的親本來源有較好的一致性。同時也表明SNP標記技術(shù)在分析甘薯親緣關(guān)系的可行性。從聚類圖中可知，桂薯96-8、九州101、浙薯255、黃金薯優(yōu)先聚為一類，則可推測這些品種之間有一定的親緣關(guān)系，但與它們的地理來源無直接關(guān)系。由此表明，根據(jù)地理來源判斷甘薯種質(zhì)的親緣關(guān)系有一定的局限性，研究結(jié)果與聶立圓等[7]結(jié)論一致。利用SNP標記技術(shù)獲得甘薯種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，可為甘薯育種在親本組配、雜種優(yōu)勢利用等方面提供直觀的技術(shù)支持。

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