劉 萍，郭富城，李林杰，李凌浩，馬曉霞，馬忠仁*

(1.西北民族大學生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅蘭州730030；2.甘肅省動物細胞工程技術研究中心，甘肅蘭州730030；3.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州730030)

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒結構蛋白組成的空心顆粒，具有天然病毒粒子形態(tài)和空間結構，但不含有病毒核酸，無感染能力，也不能自主復制[1-2]。許多病毒的結構蛋白在異源系統(tǒng)內(nèi)重組表達即可自裝配形成VLPs，這些VLPs 的形態(tài)和結構與真正的病毒粒子相似，大小介于15 nm～400 nm，具有天然病毒粒子的空間構象和與天然病毒相似的免疫原性。機體免疫系統(tǒng)能夠高效識別VLPs 并產(chǎn)生特異的細胞免疫、體液免疫及黏膜免疫等免疫應答[2]。VLPs 在結構上允許外源基因或基因片段插入，將其它病原誘導的中和抗體的抗原表位展示在VLPs 表面，形成嵌合型VLPs，因此也可以作為各類疾病新型疫苗的展示平臺，目前VLPs 已成為研究熱點[3]。另外，VLPs 還具有包裹核酸或經(jīng)表面修飾后攜帶其它分子的能力，作為一種潛在的基因或藥物的投遞工具，具有廣闊的應用前景[4]。本文對VLPs 的抗原特性、制備及其在重要動物疫病疫苗的研究和應用進行綜述。

1 VLPs的抗原特性

不同病毒來源的VLPs其結構與親本病毒在形態(tài)大小和結構上高度相似，例如結構較為簡單的細小病毒、圓環(huán)病毒、戊型肝炎病毒等的VLPs 由1 種或2 種結構蛋白組成；而流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等的VLPs具有來自宿主細胞的脂質(zhì)膜結構以及經(jīng)糖基化修飾的病毒纖突蛋白。因此，VLPs 具有與天然病毒類似的病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，能夠與天然免疫系統(tǒng)中的模式識別受體結合，激活天然免疫反應。VLPs 的體積較小，容易通過淋巴管進入淋巴結中。在淋巴結，VLPs 可以被定居于淋巴結中的樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)攝取[5]。DC 是機體內(nèi)功能最強大的專職性抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)。VLPs高度有序的表位結構和納米量級的粒徑有利于DC 的吞噬和抗原加工處理。VLPs 能夠促進DC 的增殖，上調(diào)CD40、CD80、CD86 等表面標志物的表達水平，同時上調(diào)主要組織相容性復合體(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ類分子的表達水平，有效提呈抗原。VLPs 上的B 細胞表位與MHC-Ⅱ類分子結合，刺激活化B 淋巴細胞，誘導機體產(chǎn)生特異性中和抗體；T 細胞表位由MHC-I 類分子提呈，能夠活化CD8+T 細胞，活化的CD8+T細胞(CTL)可以直接殺死被病原感染的細胞從而清除病毒或其它細胞內(nèi)寄生的病原體，VLPs 也能夠促進IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α 等細胞因子的分泌，刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應答[6]。

2 VLPs的表達系統(tǒng)

制備VLPs 的重組蛋白表達系統(tǒng)分為真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。其中，真核表達系統(tǒng)包括哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，酵母表達系統(tǒng)和桿狀病毒/ 昆蟲細胞表達系統(tǒng)以及植物細胞表達系統(tǒng)等。原核表達系統(tǒng)主要為大腸桿菌表達系統(tǒng)。目前已報導的VLPs 約70 %由真核表達系統(tǒng)制備，約30 %由原核表達系統(tǒng)制備。

2.1 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 制備與人類或動物疾病密切相關的病毒的VLPs 是人們最關注的熱點問題。這些病毒是以人或動物的細胞為天然宿主進行復制和增殖。哺乳動物細胞具有最完善的病毒蛋白質(zhì)翻譯和翻譯后修飾系統(tǒng)，能夠精確地完成糖基化、磷酸化、二硫鍵形成、蛋白質(zhì)折疊與空間構象的形成等翻譯后加工過程，產(chǎn)生的病毒蛋白具有完整的結構和功能，有利于VLPs 的高效包裝，并保證VLPs 的活性。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的這一優(yōu)點使其被大量應用于疫苗和治療性重組蛋白的研究和生產(chǎn)中[7]。中國倉鼠卵巢細胞(CHO)是該系統(tǒng)最常用的表達細胞。目前人用乙肝疫苗GenHevac B?、BioHep?(Sci-B-VacTM)和Hepacare?均是在CHO 中表達制備的。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)也存在一些不足之處：生產(chǎn)成本較高，目的蛋白表達量低，表達外源蛋白的穩(wěn)定性不足等。在實際生產(chǎn)中，通過改進生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高目的蛋白表達水平，是相關企業(yè)和研究者需要解決的最大問題。

2.2 酵母表達系統(tǒng) 酵母表達系統(tǒng)是一種應用廣泛的重組蛋白真核表達系統(tǒng)，也被應用于VLPs 的制備。畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和漢遜酵母(Hansenula yeast)是常用的酵母細胞，可以對表達的蛋白進行翻譯后修飾以使其具有正確的構象和生物活性，但酵母的翻譯后修飾功能有限，特別是蛋白糖基化的不足，常用于無囊膜VLPs 的制備。Merck 公司采用酵母表達系統(tǒng)開發(fā)出了乙型肝炎病毒(HBV)和人乳頭瘤病毒(HPV)VLPs 疫苗。酵母細胞也具有同時表達多種亞單位蛋白，并將其組裝成VLPs 的能力，例如同時表達輪狀病毒的3 種結構蛋白，并將其組裝成多層VLPs[8]。

2.3 桿狀病毒/ 昆蟲表達系統(tǒng) 桿狀病毒/ 昆蟲表達系統(tǒng)是近年來廣泛應用的高效表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)之一。桿狀病毒具有嚴格特異的感染嗜性，只能感染昆蟲細胞，對脊椎動物不致病，也不產(chǎn)生內(nèi)毒素，不存在生物安全問題；基因組較大，可以容納較大片段的外源基因，蛋白大都以可溶性表達，表達效率高；高表達的外源蛋白在昆蟲細胞內(nèi)可以進行與哺乳動物細胞幾乎相同的折疊、二硫鍵形成、糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐半亩蔚那懈畹?，使重組蛋白具有良好免疫原性；此外，昆蟲細胞還可以高密度懸浮連續(xù)培養(yǎng)，容易擴大生產(chǎn)規(guī)模，適合于重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，桿狀病毒/ 昆蟲表達系統(tǒng)制備各種類型VLPs 的優(yōu)勢使其成為疫苗開發(fā)者最新關注的VLPs 表達系統(tǒng)?；谠撓到y(tǒng)，葛蘭素史克公司已經(jīng)成功開發(fā)出人用HPV16 型和18 型VLPs 疫苗Cervarix?，并于2009年得到美國食品和藥物管理局(FDA)批準。用該系統(tǒng)制備VLPs 疫苗也存在一些潛在的問題，即制備的VLPs 顆粒大小與桿狀病毒粒子類似，二者存在共表達，容易被污染，因此，純化是該系統(tǒng)制備VLPs 疫苗所面臨的最大挑戰(zhàn)[9]。

2.4 大腸桿菌表達系統(tǒng) 大腸桿菌(E.coil)表達系統(tǒng)是目前制備重組蛋白最廣泛的表達系統(tǒng)，也可以用來表達一些無囊膜病毒的結構蛋白，并組裝形成VLPs。目前，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備VLPs 的技術已經(jīng)比較成熟。該系統(tǒng)的一個特點是表達量大，外源蛋白常常以包涵體形式存在。制備VLPs 需要對包涵體復性，研究者更多的是利用低溫培養(yǎng)，或通過引入分子伴侶蛋白SUMO 的策略促使目的蛋白以可溶性的方式表達，以便VLPs 的高效組裝。在大腸桿菌表達系統(tǒng)中也可以同時表達多個結構蛋白實現(xiàn)多層蛋白VLPs 的共組裝[10]。由于大腸桿菌內(nèi)沒有與真核細胞類似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾系統(tǒng)，因此不適合用于表達需經(jīng)翻譯后修飾的形成VLPs 的亞單位蛋白，也不能用于有囊膜VLPs 的生產(chǎn)[10]。值得一提的是，全球首個成功上市的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)疫苗的抗原就是由大腸桿菌表達系統(tǒng)表達其E2 蛋白N 端部分制備的VLPs。

3 動物用VLPs疫苗的研究進展

VLPs 具有與天然病毒相似的構象表位、可以重復且高密度展示抗原表位，表現(xiàn)更強的免疫原性，能夠誘導有效的免疫應答，但又不具有感染性，比減毒活疫苗和滅活苗安全，比其他類型亞單位疫苗更有效。隨著人用的HPV、HBV、H9N2 流感病毒及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)等的VLPs 疫苗成功上市，用于動物疫病預防的VLPs 疫苗的研究也不斷取得突破性進展。

3.1 口蹄疫的VLPs口蹄疫(Foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由FM 病毒(FMDV)引起的偶蹄動物常發(fā)的一種烈性傳染病，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)，嚴重威脅家畜安全和國際畜產(chǎn)品貿(mào)易，OIE 將其列為A 類傳染病之首。傳統(tǒng)的滅活疫苗仍是當前防控該疫病的主要疫苗。為更好的防控和凈化FMD，近年來，利用基因工程技術制備針對FMDV 的新型疫苗，如標記疫苗、復合表位肽疫苗、VLPs 疫苗等取得了一定進展。其中VLPs 疫苗顯示出良好的應用前景。Cao 等較早嘗試了以重組桿狀病毒為載體將O 型和亞洲I 型FMDV 的P1、2A、3C 基因在High Five 昆蟲細胞中表達，該幾種蛋白能夠自我組裝形成與親本病毒粒子大小相同的VLPs，具有一定的免疫原性，但免疫豚鼠未能獲得高水平的中和抗體[11]。Li 等同樣在昆蟲細胞表達了上述3 個FMDV 結構蛋白并成功組裝了VLPs。以此VLPs 疫苗免疫牛，通過間接免疫熒光和夾心ELISA 檢測到FMDV 特異性抗體，攻毒試驗顯示，該疫苗半數(shù)保護量(PD50)可達6.34/ 頭份，超過OIE 規(guī)定的標準(3 PD50/ 頭份)[12]。Mohana 等將O 型FMDV 的P1、2A、3C 連接到pFastBac 表達載體中，構建的重組桿狀病毒在Sf9 細胞中也能表達并組裝形成相應的VLPs。將該VLPs與ISA206 佐劑混合后免疫牛，經(jīng)兩次免疫后可以檢測到中和抗體，攻毒試驗顯示，該疫苗每頭份合5.01 PD50[13]。利用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)表達FMD-VLPs 的例子還有很多。這些研究表明，亞洲I 型和O 型FMDV 的P1、2A、3C 蛋白由重組桿狀病毒系統(tǒng)表達、組裝形成的VLPs 可以作為疫苗。Guo 等也嘗試了利用原核表達系統(tǒng)組裝FMDV VLPs，研究將亞洲I 型FMDV 的VP1、VP3 和VP0 分別與SUMO 融合使之在大腸桿菌中共表達，這3個結構蛋白在去除SUMO 基團后可以組裝形成VLPs。動物免疫試驗顯示，含50 μg 蛋白的VLPs 單劑量免疫豚鼠、豬和牛即可誘導高水平的免疫應答。對牛的攻毒保護試驗結果顯示，每頭份含50 μg 蛋白的VLPs 疫苗可達到6.3 PD50[14]。這項研究表明，利用原核表達系統(tǒng)表達FMDV 的結構蛋白，也可以組裝VLPs，并可以做為候選疫苗。除了構建由FMDV 自身結構蛋白組裝的VLPs 的外，嵌合VLPs 也是FMDV 疫苗的一個研究方向。有學者將FMDV 主要保護性抗原或抗原中的B、T 細胞表位與其它病毒自組裝成VLPs 的結構蛋白融合表達使其展示于嵌合VLPs 的表面，在免疫動物時能夠刺激機體產(chǎn)生針對FMDV 的特異性免疫應答。例如，基于乙肝核心抗原(HBcAg)融合FMDV 全長VP1 組裝成的VLPs，相比可溶性的VP1 蛋白，能夠更有效刺激小鼠產(chǎn)生高水平的T 細胞增殖和CTL 應答，及中和抗體的產(chǎn)生[15]。

為大規(guī)模工業(yè)化制備FMDV 的VLPs，研究者也在做大量的工作。Kumar 等將O 型FMDVIND/R2/75 株的P1-2A-3C 蛋白串聯(lián)，構建重組桿狀病毒，將該重組桿狀病毒經(jīng)口或血管腔內(nèi)注射感染蓖麻蠶幼蟲，在感染后3 d～7 d 能夠從幼蟲血淋巴中獲得大量VLPs，且VLPs 產(chǎn)量明顯高于該重組桿狀病毒感染的SF9 細胞。ELISA 檢測顯示，從蓖麻蠶幼蟲體內(nèi)獲得的VLPs 可以與FMDVIND/R2/75 株的陽性血清反應，再用該陽性血清做western blot檢測VLPs，顯示在26 ku、37 ku 和47 ku 處有3 條目的條帶。采用經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化的VLPs 免疫兔子和豚鼠，其血清能夠與FMDVIND/R2/75 株抗原發(fā)生反應，表明該方法能夠制備具有免疫原性的VLPs。作者認為以蓖麻蠶幼蟲為宿主可以大規(guī)模生產(chǎn)FMDV VLPs 疫苗[16]。Xiao 等開發(fā)了大腸桿菌共表達系統(tǒng)，在同一個質(zhì)粒中串聯(lián)表達FMDV 的3 個衣殼蛋白VP0、VP1 和VP3，共表達的FMDV 衣殼蛋白也可以在10 L 的發(fā)酵罐中大規(guī)模生產(chǎn)，利用色譜純化目的蛋白并在體外自組裝形成VLPs。單一劑量FMDV VLP 與佐劑混合后免疫?？梢哉T導牛產(chǎn)生抗FMDV 的ELISA 抗體和中和抗體，抗體持續(xù)期可達6 個月。該VLP 疫苗可以誘導免疫牛產(chǎn)生較好的保護作用，PD50可達到11.75/頭份[17]。

3.2 小反芻獸疫的VLPs 小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是近年來傳入我國的一種山羊和綿羊急性、烈性、高度接觸性傳染病，由PPR 病毒(PPRV)引起，被我國列入一類動物疫病名錄，OIE 列為A 類烈性傳染病。從事該病原的研究需要生物安全3 級以上的條件設施。VLPs 技術為在普通實驗室模擬研究該病原的生物學特性和疫苗研發(fā)提供了有力工具。F、H 和N 蛋白是PPRV 的主要保護性抗原，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，常作為VLPs 疫苗的候選抗原，M 蛋白在PPRV VLPs 的組裝過程中發(fā)揮關鍵作用。Wang 等將PPRV 的N、M、H 和F 蛋白在Vero 細胞中表達，這4 種蛋白共表達可以高效的組裝和釋放VLPs，與病毒自然感染形成自帶病毒粒子的效率相當。將M 和F 蛋白共表達也能夠有效組裝和釋放VLPs。但如果無M 蛋白，N、H 和F 單表達或共表達均不能組裝和釋放VLPs，這表明M 蛋白對于VLPs 的形成至關重要[18]。Liu 等根據(jù)昆蟲細胞密碼子的偏好對M 基因，H 基因進行了密碼子的優(yōu)化，并將它們與N 基因一起構建重組桿狀病毒。Western blot 等方法檢測到重組桿狀病毒在昆蟲細胞中共表達這3 種結構蛋白，透射電鏡觀察到VLPs 穿過細胞膜的出芽過程，純化后的該VPLs 在形態(tài)學上與親本病毒相似，但粒徑較小[19]。他們還將M蛋白和N 蛋白利用桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲中表達，組裝出了VLPs，該VLPs 的粒徑與由3 種結構蛋白形成的VLPs 類似，在100 nm～150 nm，均明顯小于親本病毒的粒徑(400 nm～500 nm)[20]。以由M、H 和N 蛋白組裝的VLPs 免疫小鼠2 次，所有免疫小鼠的血清中均可以檢測到PPRV 特異性的中和抗體[21]。Li 等對由M、H 和N 蛋白組裝的VLPs 進行了小鼠和山羊的免疫試驗，結果顯示，皮下注射VLPs 能夠誘導小鼠產(chǎn)生PPRV 特異性的IgG 和高水平的中和抗體。該VLPs 在不加佐劑單獨免疫的情況下與相同劑量的PPRV 弱毒疫苗具有相當?shù)拿庖咝Ч?。這項研究也提示，VLPs 作為PPRV 疫苗的候選抗原，在凈化該疫病時還具有能夠區(qū)分血清學陽性動物為野毒感染或疫苗免疫的潛力[22]。

3.3 豬繁殖與呼吸綜合征的VLPs 我國于2006年暴發(fā)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，其感染率和死亡率極高，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。PRRSV變異較快，傳統(tǒng)疫苗對其保護性較差，尤其是滅活苗誘導低效價中和抗體時，會發(fā)生抗體依賴作用，反而感染程度增強。弱毒苗對HP-PRRSV 保護作用較好，但存在散毒和毒力返強等潛在的缺陷。因此VLPs 可以作為安全有效的PRRSV 新型疫苗的一個發(fā)展方向。

Nam 等將PRRSV 的GP5 和M 蛋白利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功制備出VLPs，以純化后的VLPs 免疫Balb/c小鼠，結果顯示該VLPs 可以刺激機體的細胞免疫和體液免疫，顯著上調(diào)IL-4、IL-10、INF-γ 的表達，4.0 μg VLPs的免疫劑量誘導INF-γ 產(chǎn)生的水平顯著高于商品化的疫苗對照，在免疫2.0 μg 和4.0 μg VLPs 的小鼠體內(nèi)檢測到中和抗體[23]。Binjawadagi 等利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構建了包含PRRSV 表面蛋白GP5-GP4-GP3-GP2a-M 或GP5-M 的PRRS-VLPs。為了增強免疫原性，將制備的VLPs 與PLGA 納米顆?；旌?，并與佐劑一起經(jīng)鼻免疫豬。結果顯示，PRRS-VLPs 能夠誘導免疫豬產(chǎn)生高水平的IgG 和IFN-γ，免疫豬攻毒后體內(nèi)IgG 和IFN-γ 水平會再次顯著上升，并且PRRSV 在免疫豬肺臟中的載量較對照組低2個數(shù)量級，表明PRRS-VLPs 不僅能夠誘導記憶性免疫反應，還具有很好的免疫保護效果[24]。也有學者嘗試將PRRSV 的保護性抗原表位插入到其它病毒的結構蛋白中構建嵌合型的VLPs 疫苗。例如以H3N2 豬流感病毒(SIV)結構蛋白HA、M1、NA 為基礎制備VPLs，融合PRRSV的GP5 構建的H3N2-PRRS 嵌合VPLs 能夠誘導針對H3N2 SIV 和PRRSV 的免疫應答[25]。利用HBV 核心抗原(HBcAg)融合PRRSV 的B 細胞、T 細胞表位，在大腸桿菌中也制備了嵌合VLPs，其免疫效果尚需進一步評價[26]。

3.4 豬圓環(huán)病毒2 型VLPs 豬圓環(huán)病毒2 型(Porcine Circovirus 2，PCV2)在我國豬群中感染比較普遍，主要引起免疫抑制，與其它病原混合感染時，可能會導致豬群大規(guī)模發(fā)病。PCV2 是一種小型無包膜的單股正鏈環(huán)狀DNA病毒，結構簡單，基因組含3 個主要的開放閱讀框(ORFs)，其中ORF2 編碼核衣殼蛋白(Cap 蛋白)。Cap 蛋白是組成PCV2 病毒粒子的唯一結構蛋白，也是該病毒的保護性抗原蛋白。針對Cap 蛋白已經(jīng)制備了多種PCV2 亞單位疫苗用于該病的預防。勃林格殷格翰以Cap 蛋白開發(fā)的PCV2 VLPs 疫苗已經(jīng)與2013年批準上市，商品名為PCV2 桿狀病毒載體滅活疫苗Ingelvac CircoFLEX?，也是首個用于動物疫病預防的VLPs 疫苗。該疫苗以桿狀病毒為表達載體，用昆蟲細胞表達的Cap 蛋白自組裝形成VLPs。

目前，以桿狀病毒表達系統(tǒng)制備PCV2 VLPs 的技術已經(jīng)比較成熟，抗原的免疫效果也很好。為了進一步降低生產(chǎn)成本，研究者也在不斷嘗試用原核表達系統(tǒng)來制備PCV2 VLPs。Yin 等將完整PCV2 ORF2 與SUMO 融合構建了原核表達載體，實現(xiàn)Cap 在大腸桿菌中的可溶性表達，電鏡觀察重組Cap 蛋白能夠自我組裝形成直徑17 nm的VLPs[27]。研究表明，在原核系統(tǒng)中，Cap 蛋白N 端核定位區(qū)(NLS)、二聚體結構形成有關的中間部分以及Cys108 對VLPs 的組裝至關重要。如果編碼Cap 蛋白的基因N 端缺失或者二聚化功能域缺失及Cys108 位氨基酸突變均會影響VLPs 的組裝[28]。Wu 等將密碼子優(yōu)化的PCV2 ORF2 全長插入表達載體pET-24a 中，在E.coliBL21 (DE3)誘導表達，重組Cap 蛋白的產(chǎn)量可達250 μg/mL，且能夠在體外組裝成直徑25 nm～30 nm 的VLPs，用該VLPs 免疫能夠誘導小鼠產(chǎn)生中和抗體和細胞免疫應答[29]。原核表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于操作簡易，成本低廉。用該系統(tǒng)制備PCV2 或其它病原的VLPs，將較大降低VLPs 疫苗的制備成本，提高疫苗的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。

3.5 其他重要動物疫病的VLPs 豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是造成妊娠母豬繁殖障礙的病原微生物之一。Ji 等利用原核系統(tǒng)表達PPV 完整的VP2 蛋白，成功獲得了VLPs。所獲得的VLPs 具有與PPV 相似的大小，形狀和血細胞凝集特性。用這些VLPs 免疫可刺激小鼠和豚鼠產(chǎn)生中和抗體。在免疫的豚鼠中也能夠誘導淋巴細胞增殖反應和細胞因子分泌，效果與用PPV 滅活疫苗免疫的豚鼠相當。此外，攻毒試驗顯示用VLPs 免疫也可以顯著降低豚鼠脾臟中的PPV 含量[30]。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)和新城疫(New castle disease，ND)是最具破壞力的家禽傳染病，由HPAIV 和NDV 引起。研究者將H5N1 HPAIV 的M1 蛋白以及血凝素(HA)的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)與NDV 的F 蛋白的胞外區(qū)融合表達，獲得的重組蛋白可以自組裝形成嵌合VLPs。用嵌合VLPs 單次免疫雞可誘導產(chǎn)生高水平的HA 特異性抗體，也能檢測到抗NDV 的抗體，并對雞隨后的HPAIV 和NDV 感染具有保護作用[31]。裂谷熱(Rift Valley fever，RVF)是由RVF 病毒(RVFV)引起的，由節(jié)肢動物傳播的急性發(fā)熱性人畜共患疾病，在非洲和阿拉伯半島盛行，并造成重大的經(jīng)濟損失。利用桿狀病毒pFastBacDual 表達系統(tǒng)，將RVFV 的N 和G 蛋白在Sf9 昆蟲細胞中共表達，獲得了RVFV VLPs。透射電鏡顯示RVFV VLPs 的形態(tài)與RVFV 粒子一致，且具有一定的免疫原性，這為未來基于VLPs 的RVFV 疫苗研究奠定了基礎[32]。藍舌病毒(Bluetongue virus，BTV)是小反芻動物藍舌病的病原，具有多種血清型。Stewart 等利用桿狀病毒表達系統(tǒng)組裝出BTV血清型8 (BTV-8)的VLPs，用BTV-8 VLPs 免疫阿爾卑斯山羊可產(chǎn)生BTV-8 特異性中和抗體，用BTV-8 強毒株攻毒，所有接種VLPs 的動物都沒有BT 或病毒血癥的臨床表現(xiàn)，這表明BTV VLPs 是安全有效的免疫原[33]。

4 展 望

VLPs 的結構特征使其能夠有效刺激機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應答，免疫原性優(yōu)于未正確折疊和修飾的可溶性重組亞單位疫苗。與減毒活疫苗相比，VLPs 不表達調(diào)控宿主免疫機能的病毒蛋白，不存在散毒和毒力返強的潛在風險，生物安全性好。與滅活疫苗相比，其生產(chǎn)工藝簡單，成本更低。這些優(yōu)勢使得VLPs 成為開發(fā)新型疫苗的熱點和趨勢。許多動物病毒的VLPs 也已經(jīng)作為一個開放的平臺，通過融合異源抗原表位基因，將抗原整合至VLPs 用于多價疫苗研制。另外，VLPs 作為診斷用抗原和小分子藥物投遞方面也顯示出了廣闊的應用前景[34]。相信隨著技術的不斷進步和研究的不斷深入，將會有更多新型獸用VLPs 疫苗成功上市并投入應用，VLPs 作為有效的重組疫苗平臺，其發(fā)展也會日趨成熟。