錢(qián) 釗，董增祥，郭美華，魯 靜，劉 亮，高春璐，茆俊東，海 鑫（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 哈爾濱 150001）

1 儀器與試藥

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；5430R高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；MS3DS25渦旋混合器（德國(guó)IKA公司）；KQ-600數(shù)控超聲波清洗器（中國(guó)昆山市超聲儀器有限公司）。

利奈唑胺對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)201424，純度99%），奧卡西平對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)201105，純度99.7%），甲醇（Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)145176，色譜純），水為超純水（實(shí)驗(yàn)室自制），其他試劑均為分析純。

收集2016年12月- 2017年4月在我院就診并使用利奈唑胺抗感染治療的門(mén)診及住院部患者血樣，共計(jì)7例。血液樣本的采集時(shí)間是在患者連續(xù)用藥5次，達(dá)穩(wěn)態(tài)后給藥前30 min內(nèi)采集靜脈血2 mL（EDTA抗凝），樣品收集后，分離血漿且注明信息于- 20 ℃下保存?？瞻籽獫{由志愿者提供。所有血漿樣品均經(jīng)我院倫理委員會(huì)審定并批準(zhǔn)使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法

2.1.1 色譜條件色譜柱：依利特Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60，v∶v）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：35 ℃。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取利奈唑胺對(duì)照品49.93 mg，用適量甲醇配制成濃度為1980 mg·L-1的儲(chǔ)備液；取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇依次稀釋配制成500、200、100、50、25、10、5 mg·L-1的7個(gè)濃度對(duì)照品溶液，同時(shí)配制高、中、低三個(gè)質(zhì)控樣品溶液（quality control，QC），濃度依次為400、200、20 mg·L-1，以上溶液均密封避光保存在4 ℃冰箱中。

精密稱取7.42 mg的奧卡西平對(duì)照品（oxcarbazepine，OXD）作為內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS），用適量甲醇配制成740 mg·L-1的儲(chǔ)備液。取適量的奧卡西平標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成200 mg·L-1的內(nèi)標(biāo)溶液，密封避光保存在4 ℃冰箱中。

2.1.3 血漿樣品預(yù)處理精密吸取180 μL空白血漿和20 μL利奈唑胺對(duì)照品溶液，置于1.5 mL離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30 s，加入600 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，離心5 min，取上層清液，過(guò)0.22 μm濾膜后，待分析。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性配制五組血漿樣品，分別為空白血漿200 μL + 甲醇20 μL、空白血漿180 μL +LZD 20 μL + 甲醇20 μL、空白血漿200 μL + IS 20 μL、空白血漿180 μL +LZD 20 μL + IS 20 μL、患者血漿200 μL + IS 20 μL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。從圖1可以看出，LZD的保留時(shí)間為7.83 min，IS的保留時(shí)間為15.66 min，二者的峰形、分離度均良好，無(wú)干擾峰。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線取5、10、25、50、100、200、500 mg·L-1的利奈唑胺對(duì)照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰面積。以LZD濃度值為橫坐標(biāo)X，以LZD與IS峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y =9.97×10-2X + 2.24×10-2（r2= 0.999，n = 7），線性范圍是0.5 ～ 50.0 mg·L-1。

2.2.3 回收率1）方法回收率：取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n = 5），按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰面積，根據(jù)線性回歸方程得出實(shí)際值；方法回收率為：實(shí)際值/理論值×100%。2）提取回收率：取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n = 5），按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，取上清液500 μL，加入40 μL甲醇，混合后進(jìn)樣分析，得到LZD與IS的峰面積比值，記為S1；取180 μL空白血漿，加入640 μL甲醇，混勻離心后取上清液500 μL，再加入20 μL QC和20 μL IS（n = 5），混勻后進(jìn)樣分析，得到LZD與IS的峰面積比值，記為S2；提取回收率為：S1/S2×100%。

在高、中、低三個(gè)濃度中，LZD的方法回收率在91.69% ～ 115.39%之間，提取回收率在81.50% ～117.31%之間。

圖1 高效液相色譜圖A - 空白血漿，B - 空白血漿 + LZD，C - 空白血漿 + 內(nèi)標(biāo)，D - 空白血漿 + LZD +內(nèi)標(biāo)，E - 患者血漿 + 內(nèi)標(biāo)；1 - LZD，2 - 內(nèi)標(biāo)（OXD）Fig 1 HPLC chromatogramsA - blank plasma, B - blank plasma + LZD, C - blank plasma + IS, D -blank plasma + LZD + IS, E - patient's plasma + IS; 1 - LZD, 2 - IS(OXD)

2.2.4 精密度1）日內(nèi)精密度：在一天內(nèi)，取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n = 5），按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，計(jì)算日內(nèi)RSD。2）日間精密度：連續(xù)5 d，取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n = 5），按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，計(jì)算日間RSD。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n= 10）20 μL，每份均加入180 μL空白血漿，渦旋混勻后密封保存在 - 20 ℃冰箱中。長(zhǎng)期穩(wěn)定性：60 d后取出5份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，計(jì)算長(zhǎng)期穩(wěn)定性的RSD。凍融穩(wěn)定性：一周后取出5份，室溫融化，反復(fù)凍融3次，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，計(jì)算凍融穩(wěn)定性RSD。室溫穩(wěn)定性：取高、中、低三個(gè)濃度的QC（n = 5），按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，在室溫下放置12 h后進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，計(jì)算室溫穩(wěn)定性RSD。

表1 利奈唑胺在患者血漿中的日內(nèi)、日間精密度. n = 5Tab 1 Intraday, interday precision of LZD in human plasma. n = 5

在 - 20℃條件下保存60 d，反復(fù)凍融3次后，其穩(wěn)定性良好，均符合穩(wěn)定性要求；具體結(jié)果如表2所示。

表2 利奈唑胺在患者血漿中的穩(wěn)定性. n = 5Tab 2 The stability of LZD in human plasma. n = 5

2.2.6 患者利奈唑胺血藥濃度的測(cè)定取臨床患者血漿樣本，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄LZD和IS色譜峰和峰面積，根據(jù)線性回歸方程得出患者血漿中的利奈唑胺濃度。檢測(cè)收集的7例患者的血漿樣本，其中有5例患者的血漿藥物濃度在2 ～ 7 mg·L-1范圍內(nèi)，有2例小于2 mg·L-1，可結(jié)合臨床癥狀評(píng)價(jià)治療效果，個(gè)體化調(diào)整藥物劑量。

3 討論

3.1 測(cè)定方法與線性范圍的確定

目前，臨床用于治療藥物監(jiān)測(cè)的檢測(cè)方法[5]主要有免疫法[6]、HPLC法[7-8]、HPLC-MS/MS[9]等。免疫法需要使用昂貴的試劑盒，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)用于LZD檢測(cè)的試劑盒；HPLC-MS/MS因其設(shè)備昂貴，并非廣泛普及的儀器；而HPLC作為一個(gè)常規(guī)的藥物分析儀器，價(jià)格低廉，且易于操作，普及性較廣；故本研究建立了LZD的HPLC檢測(cè)方法。有研究表明利奈唑胺的有效濃度為2 ～ 7 mg·L-1[10-11]，本方法建立的線性范圍為0.5 ～ 50.0 mg·L-1，可以滿足日常LZD藥物濃度檢測(cè)。

3.2 流動(dòng)相及前處理方法的選擇

本研究選擇的流動(dòng)相為最常見(jiàn)、最簡(jiǎn)單的甲醇-水，成本低廉，且不需要繁瑣的操作過(guò)程（如各種緩沖鹽）[7,12]；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了流動(dòng)相比例對(duì)LZD和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間和分離的影響，最終確定甲醇與水的比例為40∶60，在此條件下分離較好且沒(méi)有內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，二者在20 min內(nèi)完成出峰。本研究前處理方法采用常規(guī)蛋白沉淀法，沉淀劑為流動(dòng)相中的有機(jī)相，較張倫等[13]的前處理方法操作更簡(jiǎn)單、易于記憶，且提取回收率、峰形均滿足要求。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇

本研究采用的HPLC法為內(nèi)標(biāo)法，較外標(biāo)法的定量更為準(zhǔn)確；內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選擇奧卡西平，是新型的抗癲癇藥，同為本實(shí)驗(yàn)室治療藥物監(jiān)測(cè)的項(xiàng)目，標(biāo)準(zhǔn)品易于獲得，且?jiàn)W卡西平在254 nm處有最大吸收。

3.4 TDM的臨床應(yīng)用

自利奈唑胺在我國(guó)上市以來(lái)，臨床應(yīng)用中多為經(jīng)驗(yàn)給藥，均按說(shuō)明書(shū)推薦的600 mg，bid的給藥方案，從療效評(píng)價(jià)的角度，多數(shù)患者并未達(dá)到最佳的治療效果[14]；因此，需要對(duì)利奈唑胺進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)。本方法的臨床應(yīng)用中共檢測(cè)了7例患者的血樣，其中有5例患者的血藥濃度在有效范圍內(nèi)，5例中有2例低于3.5 mg·L-1，另外2例低于LZD有效范圍，提示藥物濃度偏低，可結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行藥物劑量的調(diào)整。

綜上所述，本研究建立的HPLC法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、易操作，便于臨床檢驗(yàn)；為臨床對(duì)利奈唑胺的TDM提供了方法學(xué)基礎(chǔ)，為劑量調(diào)整提供參考，為最終實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療方案及合理用藥提供強(qiáng)有力的依據(jù)。