任 韡，黃曉舞，劉 坤，蘇歡歡，范金釗，白 林，李 欣（.解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 00853；.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070）

撲麻滴鼻液收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2015年版），主要成分為鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏，用于治療過敏性鼻炎、鼻竇炎、鼻黏膜腫脹等[1]。鹽酸麻黃堿被納入易制毒化學(xué)品管理，長期或超劑量使用可導(dǎo)致鼻黏膜萎縮，并可產(chǎn)生藥物依賴，對于心臟病和高血壓的患者，可引起血壓升高、心率加快等副作用。馬來酸氯苯那敏為抗組胺藥，可引起消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)[2]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定方法顯示色譜基線不好，鹽酸麻黃堿峰受溶劑峰干擾大，馬來酸氯苯那敏峰矮且寬，測定結(jié)果準(zhǔn)確性差，所以有必要進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立更加準(zhǔn)確、有效的含量測定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（包括1200系列在線脫氣機(jī)、四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、VWD檢測器、色譜工作站，美國Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；色譜柱：Dikma Platisil ODS柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；pH計（SevenEasy，德國Mettler公司）；MS250DU型電子天平（德國Mettler公司）。

撲麻滴鼻液（本院自制，批號：20170713、20170927、20171012）；馬來酸氯苯那敏對照品（批號：100047-201507，純度99.7%），鹽酸麻黃堿對照品（批號：171241-201007，純度99.7%），均來源于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純；磷酸二氫銨、三乙胺、磷酸、磷酸二氫鉀、異丙醇等均為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸二氫銨緩沖液（稱取磷酸二氫銨11.5 g加水溶解，加磷酸1 mL，加水稀釋至1000 mL，搖勻即得）-乙腈（80∶20）；檢測波長：257 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃[3]；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液精密稱取鹽酸麻黃堿對照品26.0 mg、馬來酸氯苯那敏對照品7.7 mg，置于25 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，制成對照品儲備液。精密量取儲備液4 mL置于10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成對照品溶液（含鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏分別為414.75 μg·mL-1、122.83 μg·mL-1）。

2.2.2 供試品溶液精密量取供試品5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻。精密量取上述溶液4 mL置于10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液另按處方比例及制備工藝，配制不含鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的空白制劑，依供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，鹽酸麻黃堿、馬來酸氯苯那敏的保留時間分別為4.5、17.4 min，峰形對稱尖銳，基線平穩(wěn)，與其他色譜峰分離良好，陰性樣品在相應(yīng)位置上無干擾峰，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系的考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品儲備液2、3、4、5、6 mL于10 mL容量瓶中，加流動相定容制成標(biāo)示含量的50%、75%、100%、125%、150%的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為：鹽酸麻黃堿Y = 0.947 X -1.548，r = 0.999 9；馬來酸氯苯那敏Y = 17.954 X - 4.103，r = 0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏分別在207.38 ～ 622.13 μg·mL-1、61.42 ～ 184.25 μg·mL-1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 HPLC色譜圖A -對照品，B - 供試品，C -陰性對照；1 -鹽酸麻黃堿，2 -馬來酸氯苯那敏Fig 1 HPLC chromatogramsA - reference substance, B - sample, C - negative reference substance;1 - ephedrine hydrochloride, 2 - chlorphenamine maleate

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次測定，計算鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的峰面積RSD（n = 6）分別為0.20%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.2.2”項(xiàng)下方法，制備6份供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，以外標(biāo)法測定，按標(biāo)示含量百分?jǐn)?shù)計算，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏分別為102.1%、101.9%，RSD分別為0.09%（n = 6）、0.20%（n =6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)行測定，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏峰面積RSD（n =6）分別為0.19%、0.41%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

按處方比例稱取鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏對照品（相當(dāng)于標(biāo)示量的80%、100%、120%），并加入其它輔料配制成低、中、高濃度樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各濃度供試品溶液各3份，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計算回收率，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏平均回收率分別為100.8%、99.4%，RSD分別為0.91%、1.30%，詳見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test. n = 9

2.9 耐用性實(shí)驗(yàn)

2.9.1 流動相pH按“2.1”項(xiàng)下方法配制流動相，用磷酸分別調(diào)節(jié)pH至2.70、3.20、3.50，進(jìn)行測定，計算鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的峰面積RSD（n = 3）分別為0.55%、0.06%，表明在pH 2.70 ～ 3.50范圍內(nèi)均能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

2.9.2 流動相比例按“2.1”項(xiàng)下方法配制磷酸二氫銨緩沖溶液，依次將流動相比例（磷酸二氫銨緩沖溶液：乙腈）調(diào)節(jié)為78∶22、80∶20、82∶18，其余條件不變，進(jìn)行測定，計算鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的峰面積RSD（n = 3）分別為0.49%、0.12%，結(jié)果表明流動相比例略有變化時，仍能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

2.9.3 柱溫分別調(diào)節(jié)柱溫為30、35、40 ℃，其余條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計算鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的峰面積RSD （n = 3）分別為0.11%、0.19%，結(jié)果表明柱溫在30 ～ 40 ℃范圍內(nèi)，均能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

2.9.4 流速分別調(diào)節(jié)流速為0.8、1.0、1.2 mL·min-1，其余條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計算鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的峰面積RSD（n = 3）分別為0.61%、0.40%，結(jié)果表明流速在0.8 ～ 1.2 mL·min-1范圍內(nèi)，均能滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求。

2.9.5 色譜柱分別換用Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Dikma Platisil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），其余條件按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示換用不同色譜柱，含量測定結(jié)果無明顯差異，表明該方法耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取3批樣品，每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以標(biāo)示量百分?jǐn)?shù)計算，結(jié)果見表2。

表2 撲麻滴鼻液含量測定結(jié)果Tab 2 Contents determination of ephedrine hydrochloride and chlorphenamine maleate in Puma nasal drops

3 討論

HPLC法測定鹽酸麻黃堿或馬來酸氯苯那敏單一組分，在藥典[4]中已有收載，關(guān)于采用HPLC法同時測定多種藥物活性成分的報道很多[5-8]，為本實(shí)驗(yàn)提供了參考。但同時測定鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏兩組分含量，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中報道較少。金麗等[9]建立了高效液相色譜法同時測定撲麻滴鼻液中鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏的含量，操作繁瑣，基線穩(wěn)定性差，鹽酸麻黃堿色譜峰受溶劑峰干擾明顯，分離度較差，色譜條件需要進(jìn)一步改善。

3.1 流動相的選擇

為提高鹽酸麻黃堿峰的分離度，減少溶劑峰的干擾，本實(shí)驗(yàn)曾嘗試改變原方法的流動相比例，延長麻黃堿的出峰時間，但馬來酸氯苯那敏保留時間受流動相比例影響較大，出峰時間過長。嘗試采用梯度洗脫方法，可以改善分離度和出峰時間，但是基線漂移現(xiàn)象嚴(yán)重，且馬來酸氯苯那敏峰形較小。反相高效液相色譜常用流動相為磷酸鹽的緩沖溶液和弱極性有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇等）的混合溶液，嘗試以乙腈-磷酸二氫銨緩沖溶液[6]、甲醇-磷酸二氫銨緩沖液[10-11]為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者不僅配制簡單，且可避免使用三乙胺等刺激性有毒試劑，鹽酸麻黃堿峰不受溶劑峰干擾，分離度得到較大改善，基線平穩(wěn)。

3.2 檢測波長的確定

原方法中采用鹽酸麻黃堿的最大吸收210 nm作為檢測波長，馬來酸氯苯那敏峰小而寬，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏峰高差異顯著。通過紫外掃描吸收曲線可得，馬來酸氯苯那敏和鹽酸麻黃堿最大吸收波長分別為262 nm、257nm[9]。嘗試采用210 nm、254 nm、257 nm、262 nm為檢測波長，結(jié)果顯示，采用257 nm為檢測波長時，兩主峰峰高差異明顯降低，馬來酸氯苯那敏峰形、基線均得到改善。

3.3 進(jìn)樣濃度的確定

采用原方法中的進(jìn)樣濃度，鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏峰高和峰面積均較小，影響含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)樣濃度提高4倍（鹽酸麻黃堿含量約為400 μg·mL-1，馬來酸氯苯那敏含量約為120 μg·mL-1），色譜分析結(jié)果顯示，改善后鹽酸麻黃堿和馬來酸氯苯那敏峰高和峰面積呈相應(yīng)比例增加，同時滿足兩組分定量測定要求。