（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450063）

香菇（Lentinus edodes），又名花菇、香蕈，是世界第二大食用菌，也是我國的特產(chǎn)之一。香菇味道鮮美、營養(yǎng)豐富，為藥食兩用的佳品。研究發(fā)現(xiàn)香菇多糖是香菇中生物活性成分，具有抗感染[1]、抗腫瘤[2]、降血糖[3]和提高免疫力[4]等多方面功效，從上世紀80年代開始，香菇多糖作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑而用于臨床，可以激活細胞免疫功能、產(chǎn)生腫瘤壞死因子，能與化療藥物合用，顯著提高抗腫瘤的效果[5-7]。近年來，香菇多糖的提取技術(shù)也日益成熟，超聲波輔助提取方法已被廣泛應(yīng)用到植物有效成分的提取中，該技術(shù)能利用超聲波的空化作用，使香菇細胞及細胞膜構(gòu)造發(fā)生改變，而不改變多糖結(jié)構(gòu)，有效成分能更快的溶入溶劑[8]，具有提高香菇多糖提取率、縮短提取時間、操作方便的優(yōu)點[9-10]。本研究以香菇為研究對象，采用超聲波輔助方法提取香菇中多糖，設(shè)計單因素試驗進行分析，以料液比、超聲功率、溫度、超聲時間為考察因素，通過正交試驗優(yōu)化香菇多糖提取工藝，在此條件下得到最佳提取工藝條件，并使用苯酚-濃硫酸方法測定香菇多糖得率，具有提取率高、節(jié)省時間、能耗低等優(yōu)點，為香菇多糖進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

香菇：鄭州市世紀聯(lián)華超市，將干香菇于烘箱中干燥，室溫密封保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖（GR）：上海阿拉丁試劑網(wǎng)；苯酚：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；濃H2SO4：洛陽市化學(xué)試劑廠；無水乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純；5%苯酚溶液：黃河科技學(xué)院藥物分析實驗室自制。

1.1.3 儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；3號藥典篩（孔徑0.36 mm，50目）、5號藥典篩（孔徑0.18 mm，80目）：浙江上虞市五四儀器篩具廠；遠紅外鼓風(fēng)干燥箱：天津市華北實驗儀器有限公司；SHZ-D（Ш）循環(huán)水式多用真空泵：邦西儀器科技（上海）有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；XFB-200型粉碎機：吉首市中誠制藥機械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 香菇的預(yù)處理

將干香菇除去雜質(zhì)，于50℃烘箱中干燥至恒重，經(jīng)XFB-200型粉碎機粉碎得香菇粉末，將粉末先后過3號和5號藥典篩、裝瓶，于室溫下密封保存。

1.2.2 超聲波輔助提取香菇多糖工藝流程

香菇→干燥→粉碎→超聲→抽濾→濃縮→加蒸餾水定容→加入5%苯酚溶液→加濃H2SO4→搖勻放置→冷卻→于紫外可見分光光度計中490 nm波長下測定吸光度值（A）。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱量1.000 0 g干燥至恒重的葡萄糖標準品，于100 mL容量瓶中加水定容，得到10 mg/mL葡萄糖儲備液。精密移取1.0 mL儲備液于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別精密移取葡萄糖標準溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水至2.0 mL，加入1.0 mL5%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，搖勻，避光靜置15 min，于紫外-可見分光光度計490 nm處測定吸光度值A(chǔ)[11-12]，并以葡萄糖標準溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標x，吸光度值A(chǔ)為縱坐標y，繪制標準曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1得線性回歸方程為：y=0.910 7x-0.184 7，R2=0.999 1，在標準溶液濃度0.2 mg/mL～1.2 mg/mL范圍內(nèi)，顯示出良好的線性關(guān)系。

1.2.4 樣品香菇多糖含量的測定

香菇多糖得率的計算公式為：

香菇多糖得率/%=（C×V×N/m）×100[13-14]

式中：C為由標準曲線得到的香菇多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容后的總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數(shù)；m為香菇粉質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗設(shè)計

分別選取料液比、超聲功率、溫度、超聲時間為單因素，分別按照超聲波輔助提取香菇多糖工藝流程進行多糖提取的單因素試驗[15]。

1.4 正交試驗設(shè)計

為了獲得香菇多糖的最優(yōu)提取工藝，根據(jù)單因素試驗得出的結(jié)果，根據(jù)料液比、超聲功率、溫度、超聲時間4個主要因素，設(shè)計四因素三水平的正交試驗，確定香菇多糖的最優(yōu)提取工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

標準曲線的繪制與單因素試驗中數(shù)據(jù)分析處理均采用OriginPro8.0軟件，每次均設(shè)置3個平行試驗，求平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 最佳料液比的確定

固定超聲時間20min，超聲功率300W，溫度60℃。準確稱取1.00 g香菇粉末于5個錐形瓶中，分別設(shè)置料液比為 1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），分別加入蒸餾水 10、20、30、40、50 mL，置于數(shù)控超聲波清洗器中，設(shè)置超聲時間20 min，冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中加蒸餾水定容，之后各移取4.0 mL溶液于50 mL容量瓶中，分別加入5%苯酚溶液2.0mL、濃硫酸10.0mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標準曲線公式得出濃度，進而計算多糖得率。該項目進行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.77%。料液比對香菇中多糖得率的影響見圖2。

圖2 料液比對香菇中多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖 2 可知，料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50 之間（g/mL），隨著料液比的增加，香菇多糖的得率也在增加，料液比在1∶50（g/mL）時香菇多糖得率最高，但在料液比為1∶40（g/mL）時多糖得率增加幅度大于在1∶50（g/mL）時的多糖得率增幅。這說明在一定濃度范圍內(nèi)，增加溶劑的量對香菇多糖的提取有利，當香菇多糖的溶出達到平衡后再增加溶劑量對多糖的提取率影響不大，另外，考慮到能耗[16]，將最佳料液比確定為 1 ∶40（g/mL）。

2.1.2 最佳超聲功率的確定

固定超聲時間 20 min，料液比 1 ∶40（g/mL），溫度60℃。準確稱取香菇粉末1.00 g于5個錐形瓶中，依次各加蒸餾水40 mL。置于數(shù)控超聲波清洗器中超聲20 min，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中加蒸餾水定容，之后各移取4.0mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0 mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標準曲線公式得出濃度，進而計算多糖得率。該項目進行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.71%。超聲功率對香菇中多糖得率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對香菇中多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖3可知，香菇多糖得率隨著超聲功率的增加先升高后降低，在超聲功率為200 W的時候多糖得率達到最高值10.52%，當超聲功率繼續(xù)增加時，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢。這可能是由于超聲波功率較低時，對香菇細胞壁破壁程度逐漸增加，使香菇中多糖溶出增多而使提取率升高，而超聲功率超過200 W時，由于功率的持續(xù)增大，超聲波的破碎效應(yīng)和熱效應(yīng)使香菇中的雜質(zhì)溶出也逐漸增多，多糖成分和雜質(zhì)可能會發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致多糖的提取率相應(yīng)下降。因此，將最佳超聲功率確定為200 W。

2.1.3 最佳超聲溫度的確定

固定超聲時間20 min，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。準確稱取1.00 g香菇粉末于5個錐形瓶中，依次各加40 mL蒸餾水。溫度分別為40、50、60、70、80℃，置于數(shù)控超聲波清洗器中超聲20 min，冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0 mL，搖勻，靜置冷卻至室溫。空白溶液為4.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490 nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標準曲線公式得出濃度，進而計算多糖得率。該項目進行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.64%。超聲溫度對香菇中多糖得率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對香菇中多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高，香菇多糖得率先升高后降低，在超聲溫度為50℃時香菇多糖得率最高，這可能是由于超聲溫度50℃時，能加快溶劑分子的擴散速度，也促進多糖的溶出，多糖得率較高。溫度超過50℃以后，多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢，尤其在50℃～60℃時，多糖得率急劇下降，則可能是由于多糖發(fā)生降解的緣故，之后多糖得率又出現(xiàn)上升的趨勢，是由于溫度的持續(xù)升高，使得多糖的氧化加重。因此，將最佳超聲溫度確定為50℃。

2.1.4 最佳超聲時間的確定

固定超聲溫度50℃，功率 200 W，料液比1∶40（g/mL）。各取1.00 g香菇粉于5個錐形瓶中，各加40 mL蒸餾水，置于數(shù)控超聲波清洗器中，超聲溫度為50 ℃。時間分別為 10、20、30、40、50 min。之后冷卻至室溫，抽濾，保留濾液。置于蒸發(fā)皿中濃縮，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容。用移液管各移取2.0 mL于5個100 mL容量瓶中定容。之后各移取4.0 mL溶液于50 mL具塞比色管中，分別加入5%苯酚溶液2.0 mL、濃硫酸10.0mL，搖勻，靜置冷卻至室溫?？瞻兹芤簽?.0 mL蒸餾水、2.0 mL 5%苯酚溶液與10.0 mL濃硫酸的混合溶液。于紫外-可見分光光度計490nm處測吸光度值A(chǔ)，代入葡萄糖標準曲線公式得出濃度，進而計算多糖得率。該項目進行平行試驗3次，求其平均值，RSD=2.56%。超聲時間對香菇中多糖得率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對香菇中多糖得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of polysaccharides from lentinan

由圖5可知，隨著超聲時間的延長，多糖成分會逐漸的溶出，在超聲時間為40 min時香菇多糖得率最高，之后又出現(xiàn)降低的趨勢，這說明超聲時間過長時，多糖的結(jié)構(gòu)可能會遭到破壞，雜質(zhì)的溶出量也會增加，導(dǎo)致香菇多糖的提取率下降。因此，將最佳超聲時間確定為40 min。

2.2 正交試驗結(jié)果

選擇料液比（A）、超聲功率（B）、溫度（C）、超聲時間（D）作為正交試驗的4個因素，每個因素設(shè)計考察3個水平，研究其對香菇中多糖得率的影響，設(shè)計L9（34）正交試驗因素水平表，試驗中香菇多糖因素水平選取見表1，試驗設(shè)計結(jié)果如表2所示：

表1 香菇多糖正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels table of polysaccharides from lentinan

表2 香菇多糖正交試驗結(jié)果表Table 2 Orthogonal experiment results and analysis table of polysaccharides from lentinan

由表1和表2中香菇多糖正交試驗結(jié)果可知，影響多糖提取率的各因素主次關(guān)系為：A＞D＞C＞B，最優(yōu)工藝參數(shù)是A3B3C2D2，香菇多糖得率最高的條件為料液比 1∶50（g/mL），超聲功率 300 W，溫度 50℃，超聲時間40 min。

2.3 驗證性試驗

為進一步驗證正交試驗結(jié)果，固定料液比1∶50（g/mL）、超聲功率300 W、溫度50℃、超聲時間40 min。精密稱取1.00 g香菇粉末在香菇多糖提取正交試驗中最優(yōu)提取工藝條件下進行試驗，平行操作3份，見表3。

表3 驗證性試驗結(jié)果Table 3 Verification testing results

如表3所示，得到的多糖得率求其平均值為11.73%，RSD=3.02%，顯示該超聲波輔助提取香菇多糖的工藝條件準確可靠，結(jié)果重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

研究以香菇多糖得率為指標，采用超聲波輔助優(yōu)化的方法提取香菇中多糖，通過單因素水平試驗分別探索料液比、超聲功率、溫度、超聲時間4個因素對香菇多糖得率的影響。在此基礎(chǔ)上設(shè)計L9（34）正交試驗因素水平表，分別篩選了上述4個因素中對香菇中多糖的提取率影響較顯著的3個水平，用四因素三水平正交試驗設(shè)計進行香菇多糖提取工藝的優(yōu)化。試驗結(jié)果顯示，采用超聲波輔助提取香菇多糖的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶50（g/mL），超聲功率 300W，溫度50℃，超聲時間40 min。結(jié)果表明：在此工藝條件下香菇多糖得率最高，并且料液比是超聲波輔助提取過程中的關(guān)鍵因素。在最優(yōu)工藝條件下進行3次平行試驗，香菇多糖平均得率為11.73%。說明該工藝條件穩(wěn)定可行，具有一定的實用價值。

香菇味道絕佳、營養(yǎng)價值高，香菇多糖藥效明顯，使得香菇在藥品和保健食品等領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。香菇多糖的提取研究能夠使香菇資源得到有效利用，為香菇多糖的深入研究開發(fā)提供參考。