蔣偉東， 朱佩琪， 周 諾

(1. 廣西口腔頜面修復(fù)與重建研究自治區(qū)級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021； 2. 廣西顱頜面畸形臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 南寧 530021；3. 頜面外科疾病診治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)， 廣西 南寧 530021)

組織形態(tài)學(xué)染色方法有助于在微觀下研究組織形態(tài)[1]，對(duì)牙根生長(zhǎng)發(fā)育階段的研究十分重要。目前，最常用的染色方法是H-E染色，該染色方法技術(shù)成熟，已廣泛應(yīng)用于組織學(xué)研究中，但其在運(yùn)用過程中仍有缺陷，如對(duì)組織間隙的染色弱、H-E試劑容易產(chǎn)生沉淀而影響染色結(jié)果等[2]。除H-E染色外，Masson染色法及Gomori染色等方法也廣泛應(yīng)用于組織學(xué)的研究，其中Masson染色法常用于膠原纖維及骨組織的染色[3-5]，而Gomori染色法能將口腔組織染成對(duì)比鮮明的紅綠色[6]。

小鼠下頜第一磨牙牙根從出生后第5天(PN5)開始發(fā)育，到出生后第21天(PN21)牙根發(fā)育基本完成，在這一過程中，牙根及其相關(guān)牙周組織發(fā)生了一系列的變化[7]。為了更好的觀察到其細(xì)致精確的組織學(xué)改變，此次研究選取處于牙根不同發(fā)育時(shí)期的ICR小鼠下頜第一磨牙作為研究對(duì)象，采用上述3種染色方法染色，比較其在牙體硬組織、牙周膜膠原纖維、牙槽骨等組織的染色效果，為研究不同發(fā)育階段牙根選擇合適的染色方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

實(shí)驗(yàn)所用ICR小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；H-E試劑盒(KGA 224)、Masson染色試劑盒(KGMST-8003)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；天青石藍(lán)B、甘油、磷鎢酸、冰醋酸、甲基綠、蘇木精染液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；硫酸鐵銨購(gòu)自成都麥卡希試劑公司；蒸餾水、變色酸2R購(gòu)自上海阿拉丁科技股份有限公司。Gomori染液的制備如下。(1) 天青石藍(lán)染液： 天青石藍(lán)B 0.5g，硫酸鐵銨5g，甘油14mL，蒸餾水100mL，將硫酸鐵銨溶于蒸餾水中，放置24h后加入天青石藍(lán)，稍加溫水煮沸，冷卻后過濾再加甘油；(2) 變色酸染液： 變色酸2R 0.8g，磷鎢酸1g，冰醋酸1mL，蒸餾水100mL；(3) 甲基綠染液： 甲基綠0.5g，蒸餾水100mL。

主要實(shí)驗(yàn)器材： 組織處理儀(STP 120)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；石蠟包埋機(jī)(LEICA EG1150H)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2235)、烤片機(jī)(LEICA HI 1220)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，采用日本Olympus光學(xué)顯微鏡采集系統(tǒng)采集圖片。

1.2 標(biāo)本制備

以小鼠出生當(dāng)日早晨定為0d(postnatal day 0, PN0)，分別選取PN5, PN7, PN14, PN21的小鼠各3只，乙醚麻醉后斷頸處死，分離下頜骨，用PBS沖洗3次后，置于4%多聚甲醛固定液(pH=7.4)中室溫固定24h，10%EDTA脫鈣液中脫鈣，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5μm厚的冠狀組織學(xué)切片，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 H-E染色法

常規(guī)方法脫蠟至水，滴加蘇木精染液染色5min，水洗，返藍(lán)10min，滴加伊紅染液20s，水洗2～3s，沖洗掉多余染液后放入梯度乙醇中脫水，置于二甲苯中，封片[6]。

1.4 Masson染色法

切片脫蠟至水，滴加1滴蘇木精染色液,染色10min，沖掉染液后流水沖洗5min，滴加1滴復(fù)合染色液，染色5min,沖掉染液后滴加1滴磷鉬酸40s,甩干后滴加苯胺藍(lán)染液2min，沖掉染液放入60°C烘箱烘干，封片[2]。

1.5 Gomori染色法

常規(guī)方法脫蠟至水，用天青石藍(lán)染液染色10min，水洗，再用明礬蘇木精染液染核，水洗，鹽酸乙醇分化，顯藍(lán)。變色酸2R染液染色5min，2%冰醋酸水溶液沖洗3次,觀察牙本質(zhì)以及牙骨質(zhì)等密質(zhì)骨呈紅色且其他部分無色后，使用亮綠染液復(fù)染1min。使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片[6]。

2 結(jié) 果

2.1 PN5時(shí)小鼠下頜第一磨牙切片3種染色法效果比較

小鼠下頜第一磨牙在PN5時(shí)，其牙冠不斷發(fā)育，牙冠硬組織繼續(xù)生成，從牙尖向牙頸延伸，開始形成上皮根鞘(Hertwig’s root sheath，HERS)[8]。3種染色法均可觀察到牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、前期牙本質(zhì)、成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞以及HERS等結(jié)構(gòu)，見圖1。H-E染色結(jié)果顯示： 各類細(xì)胞以及HERS的形態(tài)清晰，細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)紫色，牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、前期牙本質(zhì)三者分界明顯。Masson法結(jié)果顯示： 圖片色彩鮮艷，牙釉質(zhì)被染成鮮紅色，牙本質(zhì)呈藍(lán)色，提示其富含膠原。HERS明顯，牙槽骨清晰可見，包繞整個(gè)牙胚，較其他兩者更為清晰，但成釉細(xì)胞與成牙本質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不太清晰。Gomori染色法結(jié)果顯示： 牙釉質(zhì)與牙本質(zhì)層次分明，牙釉質(zhì)被染成暗紅色，牙本質(zhì)呈藍(lán)灰色，但各類細(xì)胞的形態(tài)不夠清晰，細(xì)胞核呈單一的藍(lán)黑色。

圖1 小鼠PN5時(shí)下頜第一磨牙3種方法染色結(jié)果Fig.1 The result of the mandibular first molar root in postnatal day 5 mice by three different staining methodsP： 牙髓，A： 成釉細(xì)胞，O： 成牙本質(zhì)細(xì)胞，E： 牙釉質(zhì)，D： 牙本質(zhì)，HERS： 上皮根鞘；放大200倍選取的范圍為放大100倍中的方框處

2.2 PN7時(shí)小鼠下頜第一磨牙發(fā)育形態(tài)學(xué)比較

小鼠的下頜第一磨牙在PN7時(shí)，牙冠發(fā)育已經(jīng)完成，頸環(huán)游離端的內(nèi)外釉上皮細(xì)胞增生成雙層細(xì)胞的HERS。根鞘內(nèi)層細(xì)胞誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞分化，使得HERS不斷生長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)牙根的形成[9]。在該時(shí)期，H-E染色、Masson法、Gomori染色結(jié)果與PN5時(shí)期基本相同。Mason法總體染色效果較其他兩種方法好，牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)以及前期牙本質(zhì)層次分明，色彩鮮艷，特別是包繞牙胚的牙槽骨輪廓清晰可見，但成牙本質(zhì)細(xì)胞與成釉細(xì)胞形態(tài)在H-E染色中最為清晰，見圖2。

圖2 小鼠PN7時(shí)下頜第一磨牙3種方法染色結(jié)果Fig.2 The result of the mandibular first molar root in postnatal day 7 mice by three different staining methodsP： 牙髓，A： 成釉細(xì)胞，O： 成牙本質(zhì)細(xì)胞，E： 牙釉質(zhì)，D： 牙本質(zhì)，HERS： 上皮根鞘；放大200倍選取的范圍為放大100倍中的方框處

2.3 PN14時(shí)3種染色法效果比較

小鼠下頜第一磨牙在PN14時(shí)，隨著HERS不斷生長(zhǎng)，牙根繼續(xù)發(fā)育，逐漸形成牙髓腔的形態(tài)，同時(shí)，在牙本質(zhì)增厚的過程中，根鞘變性中斷，根鞘細(xì)胞進(jìn)入牙囊中，牙囊細(xì)胞再移向根部牙本質(zhì)，與牙本質(zhì)接觸后，分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，分泌牙骨質(zhì)基質(zhì)，礦化形成牙骨質(zhì)[10]。這一階段是牙周組織形成的關(guān)鍵時(shí)期，組織學(xué)著重觀察其HERS以及牙骨質(zhì)、牙周膜韌帶和支持性牙槽骨等。

在3種染色方法結(jié)果中，牙釉質(zhì)因?yàn)槊撯}，不能觀察到。H-E染色結(jié)果顯示： HERS細(xì)胞形態(tài)清晰，牙周膜成纖維細(xì)胞及牙槽骨清晰可見，但膠原纖維形態(tài)不夠分明。Masson染色結(jié)果顯示： HERS比較直觀；牙周膠原纖維排列整齊、規(guī)則；牙槽骨形態(tài)也比較清晰，與周邊玫瑰紅的肌肉組織界限分明，與H-E染色相比效果更好，但牙周膜成纖維細(xì)胞染色效果較差。Gomori染色效果是三者中最差的，細(xì)胞形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)層次均不清晰，見圖3。

圖3 小鼠PN14時(shí)下頜第一磨牙3種方法染色結(jié)果Fig.3 The result of the mandibular first molar root in postnatal day 14 mice by three different staining methodsHERS： 上皮根鞘，AB： 牙槽骨，PDL： 牙周纖維，P： 牙髓，D： 牙本質(zhì)；放大200倍選取的范圍為放大100倍中的方框處

2.4 PN21時(shí)3種染色法效果比較

小鼠的下頜第一磨牙在PN21時(shí)，牙根發(fā)育基本完成，牙齒已經(jīng)萌出[11]。在3種染色方法結(jié)果中，牙釉質(zhì)因經(jīng)脫鈣處理，無法被觀察到；該時(shí)期牙骨質(zhì)和牙本質(zhì)分界不清；但牙槽骨、牙周纖維及牙骨質(zhì)三者界限分明。H-E染色結(jié)果顯示： 牙本質(zhì)與牙骨質(zhì)呈淡粉紅色，牙周組織中，牙周膜纖維細(xì)胞呈梭形排列，牙周纖維形態(tài)清晰但對(duì)比度不強(qiáng)。Masson染色結(jié)果結(jié)果顯示： 牙本質(zhì)呈靛藍(lán)色，牙周組織中膠原纖維排列規(guī)則整齊，但牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)不清。Gomori染色結(jié)果中，牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)以及牙槽骨染色呈灰色；牙周組織中，成纖維細(xì)胞核形態(tài)清晰，但膠原纖維排列不夠清晰，見圖4。

3 討 論

牙齒的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。研究[12-13]表明，哺乳類動(dòng)物的牙齒發(fā)育是牙源性上皮與牙源性間充質(zhì)相互作用的結(jié)果。有關(guān)牙齒的生長(zhǎng)發(fā)育國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)做了大量的研究，但多集中在牙齒開始發(fā)育到牙冠發(fā)育成熟，對(duì)牙根發(fā)育的研究相對(duì)較少，且對(duì)于牙根的研究相對(duì)集中于牙周纖維、HERS和上皮剩余等組織[14]。當(dāng)牙冠發(fā)育即將完成之時(shí)，成釉器的內(nèi)釉上皮和外釉上皮在頸環(huán)處增生，向未來根尖孔方向生長(zhǎng)，形成稱為HERS的雙層組織，從而啟動(dòng)了牙根發(fā)育[15]。本研究通過比較H-E染色法、Masson法和Gomori染色法在小鼠磨牙牙根不同發(fā)育階段的染色效果，篩選出不同組織在不同時(shí)期中最優(yōu)的染色結(jié)果，這對(duì)系統(tǒng)而全面的研究牙根發(fā)育形態(tài)學(xué)具有重要的意義。

圖4 小鼠PN21時(shí)下頜第一磨牙3種方法染色結(jié)果 Fig.4 The result of the mandibular first molar root in postnatal day 21 mice by three different staining methodsAB： 牙槽骨，PDL： 牙周纖維，RD： 根部牙本質(zhì)，P： 牙髓，D： 牙本質(zhì)；放大200倍選取的范圍為放大100倍中的方框處

在這3種方法中，H-E染色方法簡(jiǎn)便，但它只能簡(jiǎn)單將細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染成紫藍(lán)色與粉紅色。且伊紅染液若不能熟練掌握染色時(shí)間，可能會(huì)導(dǎo)致染色偏紅。Masson法雖然相對(duì)復(fù)雜，但能夠根據(jù)組織的密度不同，將牙齒的牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)、牙骨質(zhì)以及牙槽骨等組織的形態(tài)進(jìn)行鮮明的對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，牙本質(zhì)、牙周膜纖維和牙槽骨因富含膠原，被染成靛藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。與H-E染色法相比，Masson染色不會(huì)出現(xiàn)染色過度的情況，切片圖像更為清晰，且3種顏色使圖片更加鮮艷。與H-E及Masson染色法比較，Gomori染色法成本便宜且染液保存時(shí)間較長(zhǎng)。Gomori染色法為兩步染色，先用天青石藍(lán)和明礬蘇木精染核，再以變色酸2R和亮綠兩種染液分別將相應(yīng)的組織和細(xì)胞成分有選擇地染成紅色及綠色。結(jié)果展示出牙釉質(zhì)呈暗紅色，牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)及牙槽骨呈灰色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，牙髓及牙周纖維呈水綠色。

從3種染色方法的效果來看，H-E染色細(xì)胞形態(tài)較為清晰，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)層次分明，但牙齒硬組織以及牙周組織層次感不強(qiáng)，適合于成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞以及HERS的細(xì)胞形態(tài)的觀察。與其相比，Masson法中牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙周纖維、HERS以及牙槽骨的形態(tài)最明顯，特別使富含膠原成分的組織染色明顯，該結(jié)果與韓天龍等[2]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，適合牙根發(fā)育過程中硬組織以及牙周相關(guān)組織的組織學(xué)研究。Gomori染色中細(xì)胞核的形態(tài)比較明顯，但牙齒硬組織以及牙周組織的界限不夠清晰，且此方法易出現(xiàn)染色不均勻，某些組織染色過深等問題，故在牙根、牙骨質(zhì)發(fā)育時(shí)期不建議使用Gomori染色。綜上所述，上述3種染色方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，研究人員可根據(jù)研究需要，選擇最合適的染色方法。